本文關鍵詞：新孢子蟲MIC6的鑒定、功能及其作用機制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學》 2015年

新孢子蟲MIC6的鑒定、功能及其作用機制的初步研究

李文生  

【摘要】：新孢子蟲(Neospora caninum)是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲,可感染多種動物。新孢子蟲在入侵宿主細胞過程中會分泌大量蛋白質(zhì),微線體分泌的多種蛋白(microneme proteins, MICs)在蟲體識別、粘附細胞中發(fā)揮重要功能。關于微線蛋白的研究已經(jīng)見于多種頂復亞門原蟲,而新孢子蟲微線蛋白的研究報道則很少。本研究以NcMIC6為主要研究對象,對NcMIC6的生物學特性、與其它微線蛋白相互作用、功能及其作用機制等進行較為系統(tǒng)的研究。 應用生物信息學方法對NcMIC6進行分析,結果顯示NcMIC6基因全長984bp,無內(nèi)含子,與弓形蟲MIC6核苷酸序列的相似性是81%；該基因共編碼327個氨基酸,與弓形蟲MIC6氨基酸序列相似性為47%。利用在線分析軟件發(fā)現(xiàn),NcMIC6蛋白含有1個信號肽,1個跨膜區(qū),3個EGF domain口2個低聚區(qū),屬于I型跨膜蛋白。 構建原核表達質(zhì)粒pET28a-NcMIC1、pET28a-NcMIC4和pET28a-NcMIC6,原核表達重組蛋白rNcMIC1、rrNcMIC4和rNcMIC6。用這三種蛋白分別免疫小鼠,制備anti-rNcMIC1、anti-rNcMIC4和anti-rNcMIC6多克隆抗體。對NcMIC6生物學特性的研究顯示：細胞內(nèi)蟲體的NcMIC6集中于蟲體前端,而正在入侵細胞的蟲體NcMIC6則位于蟲體后端；體外入侵阻斷實驗結果表明,anti-rNcMIC6多抗可有效阻止新孢子蟲入侵宿主細胞；微線蛋白分泌試驗發(fā)現(xiàn),當溫度高于25℃或蟲體內(nèi)鈣離子濃度升高時,蟲體會分泌大量NcMIC6。 對NcMIC6與其它相關蛋白的相互作用進行研究。免疫共沉淀實驗結果證實,NcMIC6與NcMIC1和NcMIC4會發(fā)生相互作用。GST-pull down勺結果顯示,NcMIC1分別與NcMIC4和NcMIC6相連,其中只含有第三個EGF domain的NcMIC6可與NcMIC1發(fā)生相互作用；對帶GST標簽的NcMIC6羧基端蛋白通過GST-pull down篩選出與其相互作用的蛋白是新孢子蟲醛縮酶(NcALD)。在細胞外進行醛縮酶結合試驗,表明NcMIC6羧基端中的色氨酸在NcMIC6與NcALD的相互作用中發(fā)揮重要作用。把色氨酸突變?yōu)楸彼岷?NcMIC6與NcALD的結合能力明顯下降。間接免疫熒光實驗顯示,NcMIC6與NcALD在蟲體內(nèi)部分共定位于蟲體前端。 構建原核表達質(zhì)粒pET28a-rNcMIC1-4-6,表達嵌合蛋白rNcMIC1-4-6,與重組蛋白rNcMIC6分別免疫小鼠,通過檢測小鼠的相關免疫學指標和攻蟲后腦內(nèi)荷蟲量,分別對rNcMIC6和rNcMIC1-4-6的免疫原性及對小鼠的免疫保護力進行評價�？贵w檢測結果表明,rNcMIC6和rNcMIC1-4-6都能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體。細胞因子檢測結果顯示,小鼠免疫rNcMIC6和rNcMIC1-4-6后血清中IL-4含量顯著升高。腦內(nèi)荷蟲量檢測結果顯示,免疫了rNcMIC6和rNcMIC1-4-6的小鼠在攻蟲36天后,腦內(nèi)荷蟲量顯著降低。以上結果說明這兩種蛋白均對小鼠人工感染新孢子蟲有一定的免疫保護力,可作為新孢子蟲疫苗研究的候選抗原。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7
【目錄】：

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本文編號：214379