發(fā)布時(shí)間：2016-12-15 21:01

  本文關(guān)鍵詞：新孢子蟲MIC6的鑒定、功能及其作用機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

新孢子蟲MIC6的鑒定、功能及其作用機(jī)制的初步研究

李文生  

【摘要】：新孢子蟲(Neospora caninum)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,可感染多種動(dòng)物。新孢子蟲在入侵宿主細(xì)胞過程中會(huì)分泌大量蛋白質(zhì),微線體分泌的多種蛋白(microneme proteins, MICs)在蟲體識(shí)別、粘附細(xì)胞中發(fā)揮重要功能。關(guān)于微線蛋白的研究已經(jīng)見于多種頂復(fù)亞門原蟲,而新孢子蟲微線蛋白的研究報(bào)道則很少。本研究以NcMIC6為主要研究對(duì)象,對(duì)NcMIC6的生物學(xué)特性、與其它微線蛋白相互作用、功能及其作用機(jī)制等進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究。 應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)NcMIC6進(jìn)行分析,結(jié)果顯示NcMIC6基因全長(zhǎng)984bp,無內(nèi)含子,與弓形蟲MIC6核苷酸序列的相似性是81%；該基因共編碼327個(gè)氨基酸,與弓形蟲MIC6氨基酸序列相似性為47%。利用在線分析軟件發(fā)現(xiàn),NcMIC6蛋白含有1個(gè)信號(hào)肽,1個(gè)跨膜區(qū),3個(gè)EGF domain口2個(gè)低聚區(qū),屬于I型跨膜蛋白。 構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NcMIC1、pET28a-NcMIC4和pET28a-NcMIC6,原核表達(dá)重組蛋白rNcMIC1、rrNcMIC4和rNcMIC6。用這三種蛋白分別免疫小鼠,制備anti-rNcMIC1、anti-rNcMIC4和anti-rNcMIC6多克隆抗體。對(duì)NcMIC6生物學(xué)特性的研究顯示：細(xì)胞內(nèi)蟲體的NcMIC6集中于蟲體前端,而正在入侵細(xì)胞的蟲體NcMIC6則位于蟲體后端；體外入侵阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,anti-rNcMIC6多抗可有效阻止新孢子蟲入侵宿主細(xì)胞；微線蛋白分泌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度高于25℃或蟲體內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí),蟲體會(huì)分泌大量NcMIC6。 對(duì)NcMIC6與其它相關(guān)蛋白的相互作用進(jìn)行研究。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),NcMIC6與NcMIC1和NcMIC4會(huì)發(fā)生相互作用。GST-pull down勺結(jié)果顯示,NcMIC1分別與NcMIC4和NcMIC6相連,其中只含有第三個(gè)EGF domain的NcMIC6可與NcMIC1發(fā)生相互作用；對(duì)帶GST標(biāo)簽的NcMIC6羧基端蛋白通過GST-pull down篩選出與其相互作用的蛋白是新孢子蟲醛縮酶(NcALD)。在細(xì)胞外進(jìn)行醛縮酶結(jié)合試驗(yàn),表明NcMIC6羧基端中的色氨酸在NcMIC6與NcALD的相互作用中發(fā)揮重要作用。把色氨酸突變?yōu)楸彼岷?NcMIC6與NcALD的結(jié)合能力明顯下降。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,NcMIC6與NcALD在蟲體內(nèi)部分共定位于蟲體前端。 構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-rNcMIC1-4-6,表達(dá)嵌合蛋白rNcMIC1-4-6,與重組蛋白rNcMIC6分別免疫小鼠,通過檢測(cè)小鼠的相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)和攻蟲后腦內(nèi)荷蟲量,分別對(duì)rNcMIC6和rNcMIC1-4-6的免疫原性及對(duì)小鼠的免疫保護(hù)力進(jìn)行評(píng)價(jià)�？贵w檢測(cè)結(jié)果表明,rNcMIC6和rNcMIC1-4-6都能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示,小鼠免疫rNcMIC6和rNcMIC1-4-6后血清中IL-4含量顯著升高。腦內(nèi)荷蟲量檢測(cè)結(jié)果顯示,免疫了rNcMIC6和rNcMIC1-4-6的小鼠在攻蟲36天后,腦內(nèi)荷蟲量顯著降低。以上結(jié)果說明這兩種蛋白均對(duì)小鼠人工感染新孢子蟲有一定的免疫保護(hù)力,可作為新孢子蟲疫苗研究的候選抗原。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.7
【目錄】：

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本文編號(hào)：214379