【摘要】：保幼激素(juvenile hormone, JH)除了在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)階段拈抗蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的作用而決定昆蟲(chóng)蛻皮或變態(tài)之外,它還在許多昆蟲(chóng)的成蟲(chóng)羽化后起促進(jìn)生殖的作用,但對(duì)JH促進(jìn)生殖的的分子機(jī)制仍缺乏了解。飛蝗(Locusta migratoria)是世界性的重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),有很強(qiáng)的繁殖能力。不同于果蠅、伊蚊、家蠶、赤擬谷盜等研究對(duì)象的生殖由JH和20E共同調(diào)控,飛蝗的卵黃發(fā)生、卵巢發(fā)育和卵成熟則由JH調(diào)控。因此,飛蝗也是研究JH調(diào)控昆蟲(chóng)生殖分子機(jī)制的一個(gè)理想模式。飛蝗的卵巢屬于無(wú)滋式(panoistic),即卵小管沒(méi)有滋養(yǎng)細(xì)胞或滋養(yǎng)絲,卵成熟所需的卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)等由脂肪體合成,通過(guò)血淋巴和卵泡細(xì)胞的胞間隙運(yùn)送到成熟過(guò)程中的卵母細(xì)胞。早期的研究發(fā)現(xiàn),飛蝗羽化后到產(chǎn)卵前的第一個(gè)促性腺周期內(nèi),脂肪體和卵泡細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)分裂(endocycle),形成高達(dá)16倍體的多倍性(polyploidy)細(xì)胞,為飛蝗生殖發(fā)育所必需,也受JH調(diào)節(jié),但不清楚其中的分子調(diào)控機(jī)制。為了解碼JH調(diào)控飛蝗生殖的分子機(jī)制,課題組通過(guò)RNA-seq方法獲取了JH缺失和JH誘導(dǎo)脂肪體的差異基因表達(dá)譜。KEGG通路分析表明,DNA復(fù)制和細(xì)胞周期信號(hào)通路分別位列第一和第四。QRT-PCR驗(yàn)證了DNA復(fù)制通路的16個(gè)基因和細(xì)胞周期通路中的13個(gè)基因都在JH誘導(dǎo)下顯著上調(diào)。本論文首先選擇在DNA復(fù)制中起核心作用的6個(gè)復(fù)制解旋酶基因(Mcm2-7)開(kāi)展進(jìn)一步的研究。對(duì)JH受體Met基因進(jìn)行RNAi后,發(fā)現(xiàn)Mcm3、Mcm4和Mcm7表達(dá)水平顯著下降。對(duì)Mcm4和Mcm7的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行序列分析,分別鑒定到Met結(jié)合的E-box-like和E-box元件。熒光素酶報(bào)告和電泳遷移實(shí)驗(yàn)均證明JH受體復(fù)合體(Met/SRC)可以結(jié)合Mcm4和Mcm7上游的E-box或E-box-like序列,直接調(diào)控Mcm4和Mcm7的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)RNAi沉默Mcm4或Mcm7,脂肪體細(xì)胞的DNA復(fù)制和細(xì)胞多倍化嚴(yán)重受阻,Vg表達(dá)大幅度下調(diào),卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟受到顯著抑制,表型與JH缺失和Met RNAi相似。這些研究結(jié)果表明,Mcm4和Mcm7在JH調(diào)控的飛蝗生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用,JH通過(guò)其受體復(fù)合體Met/SRC直接調(diào)控Mcm4和Mcm7的表達(dá),影響細(xì)胞的DNA復(fù)制和多倍化,進(jìn)而調(diào)節(jié)卵黃生成、卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟。Mcm2-7加載到DNA復(fù)制起點(diǎn)形成復(fù)制前體依賴于Cdc6,而Cdc6在JH誘導(dǎo)的差異基因表達(dá)譜中也顯著上調(diào)。鑒于Cdc6在DNA復(fù)制和細(xì)胞周期檢控中的重要作用,本論文也對(duì)Cdc6在JH調(diào)節(jié)的飛蝗生殖發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。QRT-PCR結(jié)果顯示,Cdc6的表達(dá)不但受JH誘導(dǎo)上調(diào),也在MetRNAi后顯著下調(diào)。對(duì)Cdc6基因上游的DNA序列進(jìn)行克隆和分析,在啟動(dòng)子區(qū)域-1063到-1058處發(fā)現(xiàn)一個(gè)E-box-like元件。利用飛蝗脂肪體和果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行電泳遷移實(shí)驗(yàn)都證明Met可以結(jié)合Cdc6啟動(dòng)子區(qū)域含E-box-like元件的20bpDNA序列。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明,JH/Met/SRC直接調(diào)控Cdc6的轉(zhuǎn)錄。Cdc6RNAi和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,Cdc6缺失不但顯著降低脂肪體細(xì)胞和卵泡細(xì)胞的倍性,也導(dǎo)致這些組織的細(xì)胞分裂；同時(shí),Vg表達(dá)、卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟都受到非常顯著的抑制；而且,上述表型缺陷在JH處理后并不能恢復(fù)到正常水平。這些研究結(jié)果表明,Cdc6參與JH調(diào)節(jié)的飛蝗細(xì)胞多倍化和生殖發(fā)育,在JH誘導(dǎo)下,Cdc6與Mcm4、Mcm7協(xié)同提高DNA復(fù)制和細(xì)胞的倍性,可能增加包括Vg在內(nèi)的所有基因的拷貝數(shù),進(jìn)而促進(jìn)Vg的大量合成,同步滿足所有首卵的成熟。此外,本論文還對(duì)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)分裂的E2f1開(kāi)展了初步研究。E2fl RNAi造成脂肪體細(xì)胞和卵泡細(xì)胞的雙核或多核化,并顯著降低細(xì)胞的倍性。與Cdc6、Mcm4或Mcm 7 RNAi相似,E2f1 RNAi后飛蝗的Vg表達(dá)、卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟也受到顯著抑制。論文的初步研究結(jié)果表明,E2f1在JH調(diào)控的飛蝗細(xì)胞多倍化過(guò)程中也發(fā)揮著非常重要的作用。以后對(duì)E2f1的進(jìn)一步研究將會(huì)闡明JH怎樣調(diào)控E2fl的表達(dá),E2f1如何作用于飛蝗細(xì)胞的內(nèi)分裂和多倍化。綜合上述研究結(jié)果,特別是對(duì)JH通過(guò)Met/SRC直接調(diào)控Mcm4、Mcm7和Cdc6的表達(dá),提高脂肪體細(xì)胞和卵泡細(xì)胞的多倍化,進(jìn)而促進(jìn)Vg的大量合成和卵成熟的解析,揭示了JH促進(jìn)昆蟲(chóng)生殖的一個(gè)重要機(jī)制。
[Abstract]:In order to decode the molecular mechanism of insect reproduction , it has been found that it is an ideal model to regulate the reproductive development of migratory locust . The expression of Cdc6 was not only up - regulated but also down - regulated after MetRNAi . The DNA sequence upstream of Cdc6 gene was cloned and analyzed .
At the same time , Vg expression , ovarian development and oocyte maturation were significantly inhibited ;
The results showed that the expression of E2f1 , Mcm7 and Mcm7 could increase the number of double - binucleate or multilateralization of the cells . The results showed that E2f1 could regulate the expression of E2fl , increase the multifold of the fat cells and the follicle cells , and then promote the large - scale synthesis of Vg and the analysis of the maturation of eggs , and reveal the important mechanism of promoting the reproduction of insect .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.2

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本文編號(hào)：2127185