【摘要】：植物中存在著豐富的葉色變異,迄今已在擬南芥、水稻、玉米、番茄和甘藍(lán)型油菜等許多植物中發(fā)現(xiàn)了多種類型的葉色突變體。黃化突變體是最常見的葉色突變體,其是研究葉綠素生物合成、葉綠體結(jié)構(gòu)和發(fā)育、光合作用機(jī)制、基因功能及核質(zhì)基因互作等等的理想材料。白菜(.Brassica rapa L.ssp.chinensis)屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種,是一種重要的葉菜類蔬菜作物。白菜黃化突變體py/m是本課題組利用自日本武藏野種苗公司引進(jìn)的白菜雜交種'華冠'為試材,通過游離小孢子培養(yǎng)獲得的一份全株黃化的雙單倍體DH系。本研究在對pylm進(jìn)行生理生化特性鑒定的基礎(chǔ)上,對突變性狀的遺傳特性進(jìn)行了分析,利用BSR-Seq方法對黃化突變基因進(jìn)行了定位。主要研究結(jié)果如下:1.突變體pylm形態(tài)特征、光合特性及葉綠體解剖特征突變體pylm自種子萌發(fā)植株通體黃化,整個(gè)生育期黃化表型穩(wěn)定。植株長勢弱小,幼苗下胚軸明顯拉長,抽薹開花較早。pylm屬于缺總?cè)~綠素型突變體,其氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、主要熒光參數(shù)以及凈光合速率均顯著低于對照品系'CK-51',說明光合色素含量降低影響到了植株的光合作用。pylm葉綠體基粒片層稀疏,結(jié)構(gòu)不規(guī)整,垛疊程度低,無淀粉粒沉積。2.突變體pylm葉綠素缺乏原因?qū)ν蛔凅wpylm葉片中8種主要的葉綠素生物合成中間代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)葉片中ALA、PBG、Urogen Ⅲ、Coprogen Ⅲ和Proto Ⅸ的含量明顯低于對照'CK-51',Mg-Proto IX、Pchlide和Chlide的含量顯著高于對照。結(jié)合pylm中Chl a含量降低的情況,推測其葉綠素生物合成受阻發(fā)生在由Chlide向Chl a酯化的過程。利用qRT-PCR技術(shù),對pylm和對照'CK-51'的34個(gè)葉綠素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)pylm中絕大多數(shù)葉綠素生物合成相關(guān)基因下調(diào)表達(dá),其中HEMA1,CHLI2,POR C,CHLP,cHLG和c4O表達(dá)下調(diào)顯著,說明突變基因影響到了多數(shù)葉綠素生物合成相關(guān)基因的表達(dá),尤其是葉綠素生物合成代謝通路下游基因的表達(dá)。3.突變體pylm下胚軸異常伸長的機(jī)制突變體pylm下胚軸的平均長度為4.41cm,明顯超過對照'CK-51'的2.63cm。石蠟切片觀察表明,pylm下胚軸細(xì)胞縱向異常伸長生長導(dǎo)致了下胚軸拉長。利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)財(cái)pylm和對照'CK-51'的下胚軸內(nèi)源激素含量進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)pylm中生長素(IAA)含量為444.50ng/g,高于對照'CK-51'的376.32ng/g;赤霉素(GA3)含量469.00 ng/g,遠(yuǎn)超對照'CK-51'的173.33 ng/g,說明IAA和GA3含量的增加是導(dǎo)致突變體pylm下胚軸異常伸長的重要原因。4.黃化突變基因py1和py2的定位遺傳分析表明,突變體pylm的黃化性狀是由2對隱性重疊基因py1和py2互作控制。用py/m與正常綠葉大白菜DH系'FT'雜交構(gòu)建F2分離群體。從F2中選取野生型和突變體表型的植株各100株,構(gòu)建兩個(gè)極端RNA混池進(jìn)行BSR-Seq分析,預(yù)測黃化突變基因相關(guān)染色體區(qū)域位置。利用F4家系1號(hào)株系中的1,520株隱性純合黃化單株進(jìn)行SSR分析,將黃化突變基因py1定位于A09染色體的Inde1zk125和SSRzk36標(biāo)記之間,遺傳距離分別為0.13cM和0.2 cM。經(jīng)與大白菜基因組比對,目標(biāo)區(qū)域約258.3kb,包含34個(gè)基因。結(jié)合BSR-Seq分析結(jié)果,預(yù)測BraA09004189為黃化突變基因py1的候選基因。BraA09004189編碼血紅素加氧酶1(Heme oxygenase 1),參與血紅素分解代謝過程。經(jīng)BraA09004189基因全長測序并與對照'CK-51'比較后發(fā)現(xiàn),二者存在1個(gè)SNPs差異。對BraA09004189表達(dá)模式分析表明,其在對照'CK-51'中的表達(dá)水平顯著高于pylm。以F4家系3號(hào)株系中的341株隱性純合黃化單株作為定位群體,將黃化突變基因py2定位在A07染色體SSRzk116和SSRzk133標(biāo)記之間,遺傳距離分別為0.7 cM和1.9 cM。上述研究結(jié)果,為最終克隆黃化突變基因py1和py2、探明2對基因互作調(diào)控葉綠素生物合成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:A variety of leaf color mutants have been found in many plants, such as Arabidopsis, rice, corn, tomato and Brassica napus. The Yellow mutant is the most common leaf color mutant. It is the study of chlorophyll biosynthesis, the structure and development of leaf green, photosynthesis mechanism, gene function and the function of the plant. .Brassica rapa L.ssp.chinensis belongs to the subspecies of Brassica Brassica in the cruciferous family Brassica, and it is an important leaf vegetable crop. The Yellow mutant py/m of Chinese cabbage is the test material of the Chinese Cabbage Hybrid 'Hua Guan', which was introduced from the Japanese Musashi wild seed company. A double haploid DH lineage obtained from microspore culture. Based on the identification of the physiological and biochemical characteristics of pylm, the genetic characteristics of the mutant traits were analyzed. The mutation gene was identified by the BSR-Seq method. The main results were as follows: 1. the morphological characteristics, photosynthetic characteristics and leaves of the mutant pylm. The mutant pylm of the green body was yellowing from the seed germination. The Yellow phenotype of the plant was stable during the whole growth period. The plant growth was weak, the hypocotyl of the seedlings was obviously elongated, and the early bolting and flowering.Pylm belonged to the total chlorophyll mutant. The stomatal conductance, the transpiration rate, the main fluorescein parameters and the net photosynthetic rate were significantly lower than those of the control strain. CK-51'showed that the decrease of photosynthetic pigment content affected the photosynthesis of the plant, the.Pylm chloroplast lamellae were sparse, the structure was irregular, the stacking degree was low, and the chlorophyll deficiency of the.2. mutant pylm without starch grain deposition was determined by the content of the intermediate metabolites of 8 main chlorophyll biosynthesis in the mutant pylm leaves. The contents of ALA, PBG, Urogen III, Coprogen III and Proto IX were significantly lower than those of the control'CK-51', Mg-Proto IX, Pchlide and Chlide were significantly higher than those of the control. The expression pattern of 34 chlorophyll biosynthesis related genes in 1'was analyzed. Most of the chlorophyll biosynthesis related genes were downregulated in pylm, of which the expression of HEMA1, CHLI2, POR C, CHLP, cHLG and c4O downregulated significantly, indicating that the mutant genes affected most of the expression of chlorophyll biosynthesis related genes, especially leaf green. The average length of the Hypocotyl in the hypocotyl extension of the hypocotyl of the.3. mutant pylm was 4.41cm, which was obviously higher than the 2.63cm. paraffin section of the control'CK-51'. The observation showed that the lengthwise elongation of the hypocotyl cells in the hypocotyl cells of the hypocotyl of pylm led to the elongation of the hypocotyl. The liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used in the pylm hypocotyl cells of the hypocotyl. The content of endogenous hormone in hypocotyl of pylm and control'CK-51'was measured by LC-MS, and the content of auxin (IAA) in pylm was 444.50ng/g, higher than that of the 376.32ng/g of the control'CK-51', and the content of gibberellin (GA3) was 469 ng/g, which was far beyond the control'CK-51'173.33 ng/g. The location genetic analysis of.4. yellow mutant gene py1 and py2 showed that the Yellow character of the mutant pylm was controlled by 2 recessive overlapping genes py1 and py2. F2 separation group was constructed with py/m and normal green leaf cabbage DH system'FT'hybridization. 100 plants of wild type and mutant body surface type were selected from F2, and two extremes were constructed. The RNA mixed pool was used for BSR-Seq analysis to predict the location of chromosome related chromosomes in the mutant gene. Using 1520 recessive homozygous yellows in F4 family 1 line, SSR analysis was used to locate the yellow mutation gene py1 between the Inde1zk125 and SSRzk36 markers on the A09 chromosome, and the genetic distance was 0.13cM and 0.2 cM., respectively, and the Chinese cabbage gene. The target area is about 258.3kb and contains 34 genes. Combined with the results of BSR-Seq analysis, it is predicted that BraA09004189 is the candidate gene for the mutation of the yellow mutation gene py1,.BraA09004189 encoding heme oxygenase 1 (Heme oxygenase 1), and participates in the heme catabolism process. After BraA09004189 based full length sequencing and compared with the control'CK-51', two persons are found. There were 1 SNPs differences. The analysis of BraA09004189 expression patterns showed that the expression level in the control'CK-51'was significantly higher than that of pylm. with the 341 recessive homozygous yellows in the F4 family 3 line as the location group, and the mutation gene py2 was located between the A07 chromosome SSRzk116 and the SSRzk133 markers, and the genetic distance was 0.7 cM and 1, respectively. .9 cM. these findings laid the foundation for the final cloning of the yellowing mutant genes py1 and py2, and exploring the molecular mechanism of 2 pairs of gene interactions regulating chlorophyll biosynthesis.
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S634.3

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本文編號(hào)：2126230