本文關(guān)鍵詞：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染誘導(dǎo)的宿主T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《浙江大學(xué)》 2015年

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染誘導(dǎo)的宿主T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答研究

楊怡  

【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲能寄生于反芻動(dòng)物皺胃引起嚴(yán)重的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病,偶爾也見于人和鼠等非適宜宿主。該病的發(fā)生呈現(xiàn)出氣候、地理、牧場(chǎng)條件和宿主生理狀態(tài)依賴性。耐藥性的產(chǎn)生和有效疫苗的缺乏給防治工作帶來(lái)困難,因此發(fā)展免疫學(xué)防治方法十分迫切。探明宿主針對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫應(yīng)答規(guī)律是發(fā)展免疫防治的重要研究方向。本研究對(duì)中國(guó)部分地區(qū)羊胃腸道寄生蟲的流行病學(xué)和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行調(diào)查分析；建立綿羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲人工單次感染模型,利用基因芯片技術(shù)分析感染前后T淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異,進(jìn)而通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析細(xì)胞因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,明確T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答規(guī)律；建立線蟲-細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)和沙鼠感染模型,觀察線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育并檢測(cè)細(xì)胞和沙鼠的免疫指標(biāo)變化,探明宿主的早期免疫反應(yīng)。研究結(jié)果將為闡明宿主針對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫應(yīng)答規(guī)律奠定基礎(chǔ)。1.中國(guó)部分地區(qū)羊胃腸道寄生蟲病的流行病學(xué)調(diào)查和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析本研究于2014年9-12月采集了來(lái)自山東、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、遼寧、河北、江蘇、天津和青海9個(gè)省(市)的490份羊糞樣品,進(jìn)行了寄生蟲蟲卵的鑒定；于2004-2013年采集了來(lái)自浙江省嘉興地區(qū)的15份捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲樣品,通過(guò)擴(kuò)增ITS-2和ND4序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明,全國(guó)各地羊胃腸道寄生蟲的感染情況均較嚴(yán)重,感染蟲種嚴(yán)重程度依次為原蟲(83.27%)、線蟲(64.29%)和絳蟲(49.80%),感染較嚴(yán)重的三個(gè)地區(qū)為天津、青海和內(nèi)蒙古,感染較輕的三個(gè)地區(qū)為江蘇、黑龍江、山東。對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲嘉興分離株的15個(gè)樣品進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,ITS-2和ND4基因在10年間均有不同程度的遺傳變異,變異范圍分別為0.0%-3.9%和0.4%-4.8%,變異程度較小且呈隨機(jī)性變化不隨年份增加規(guī)律發(fā)生。本調(diào)查結(jié)果將為制定更合理的寄生蟲防控方案提供參考依據(jù)。2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染誘導(dǎo)宿主T淋巴細(xì)胞差異基因表達(dá)譜的分析為研究宿主T淋巴細(xì)胞應(yīng)對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的免疫應(yīng)答,本試驗(yàn)將人工培養(yǎng)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性三期幼蟲(L3)單次攻入綿羊體內(nèi)建立了感染模型。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染綿羊后25d開始產(chǎn)卵,30d時(shí)達(dá)到頂峰,最高日產(chǎn)卵量為2,475卵/克糞,產(chǎn)卵時(shí)間持續(xù)18 d,證明寄生成功。感染30 d和60 d時(shí)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)都顯著增強(qiáng),表明綿羊感染后細(xì)胞免疫反應(yīng)被激發(fā)。血清中總IgG含量隨感染日齡增加而上升,在30 d時(shí)達(dá)到頂峰,之后緩慢下降,直至穩(wěn)定寄生時(shí)仍處于高含量,證明感染也誘發(fā)了綿羊的體液免疫反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)感染模型建立成功。在此基礎(chǔ)上,分離了感染后0 d、3d、30d和60d的綿羊T淋巴細(xì)胞,通過(guò)基因芯片技術(shù),比較了感染后各日齡之間T淋巴細(xì)胞的差異表達(dá)基因,分別在3d vs. 0d、30d vs. 0d、60d vs. 0d、30d vs. 3d、60d vs.3d和60d vs.30d比較組中獲得了853、242、42、1058、805和102個(gè)差異表達(dá)基因。GO分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因功能聚類主要為細(xì)胞組分、代謝過(guò)程、生物過(guò)程調(diào)節(jié)等,KEGG分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞交流、細(xì)胞生長(zhǎng)與衰亡、免疫系統(tǒng)過(guò)程等途徑。對(duì)SLC9A3R2、ABCB9、COMMD4、SUGT1、FCER1G、 GSK3A, PAK4和FCER2等20個(gè)特異性表達(dá)的重要基因分析顯示,它們的功能主要與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持和免疫反應(yīng)有關(guān)�？谷湎x感染的重要因子IL-13在感染后60 d表達(dá)量上升,推測(cè)可能與感染后期綿羊徹底清除捻轉(zhuǎn)血矛線蟲有關(guān)。研究在一定程度上闡明了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染宿主T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答規(guī)律。3.綿羊T淋巴細(xì)胞應(yīng)對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的免疫應(yīng)答研究基于綿羊感染模型,本試驗(yàn)運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了T淋巴細(xì)胞中13個(gè)經(jīng)典細(xì)胞因子的表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果顯示感染3d時(shí),調(diào)節(jié)型細(xì)胞因子IL-10和TGF-β表達(dá)升高,預(yù)示著綿羊早期感染時(shí)調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答占主導(dǎo)地位。感染30 d時(shí),Thl型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF和Th2型細(xì)胞因子IL-13、IL-15、IL-33的表達(dá)量上調(diào),提示機(jī)體內(nèi)免疫環(huán)境逐漸由調(diào)節(jié)型轉(zhuǎn)變?yōu)門hl型和Th2型。感染60 d時(shí),Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF表達(dá)量上調(diào)而其他類型細(xì)胞因子表達(dá)量下降或無(wú)表達(dá)差異,表明Thl型免疫應(yīng)答發(fā)揮主要作用。本試驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明了T淋巴細(xì)胞參與抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的免疫應(yīng)答。4.線蟲-細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立與體外早期免疫應(yīng)答研究為研究宿主的早期免疫應(yīng)答,本研究使用細(xì)胞小室建立了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲-胃癌細(xì)胞氣液界面共培養(yǎng)系統(tǒng),觀察到線蟲在共培養(yǎng)系統(tǒng)中以弦運(yùn)動(dòng)和圓運(yùn)動(dòng)的方式生活；通過(guò)細(xì)胞遠(yuǎn)紅外熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)線蟲以細(xì)胞蛋白為食維持基本營(yíng)養(yǎng),進(jìn)食的方式可能為叮咬胃癌細(xì)胞后吸食；脫鞘幼蟲在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)發(fā)育速度緩慢,共培養(yǎng)0d、4d和7d的蟲體長(zhǎng)度分別為981.5±24.3μm、1113.9±24.4μm和1157.0±47.6μm,其中7d時(shí)與宿主感染4d體內(nèi)的蟲體大小相似。結(jié)果表明共培養(yǎng)系統(tǒng)較為可靠。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中互相脅迫,線蟲呈現(xiàn)活力下降和蜷縮狀的生理狀態(tài),同時(shí)貼壁細(xì)胞逐漸從膠原板脫落并進(jìn)入壞死狀態(tài)。相較于共培養(yǎng)0d時(shí),共培養(yǎng)4d時(shí)MGC壞死的比例由12.91%增加到53.25%,BGC壞死的比例由2.63%增加到24.81%。線蟲還能誘發(fā)細(xì)胞表達(dá)大量的IL-33,MGC與線蟲共培養(yǎng)4d和7d時(shí)IL-33的表達(dá)量分別上升至共培養(yǎng)0d時(shí)的2.520倍和4.180倍,BGC與線蟲共培養(yǎng)4d和7d時(shí)IL-33的表達(dá)量分別上升至共培養(yǎng)Od時(shí)的1.732倍和5.150倍,這與宿主早期感染時(shí)IL-33的高表達(dá)一致。本試驗(yàn)通過(guò)體外試驗(yàn)分析了早期感染對(duì)宿主造成的損傷和誘發(fā)的免疫應(yīng)答。5.沙鼠感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲模型的初探為建立方便有效的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用以研究宿主的早期免疫應(yīng)答,本試驗(yàn)使用沙鼠感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲。結(jié)果顯示,沙鼠胃組織中獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲處于四期早期,感染4d、7d和18d的蟲體長(zhǎng)度分別為1099.8±169.0μm、1273.0±121.7μm和1553.4±132.8μm。感染4d的幼蟲已出現(xiàn)性別分化,感染7d的雌蟲生殖原基分化出雌驅(qū)器原基,生長(zhǎng)發(fā)育明顯但較同時(shí)期羊體內(nèi)滯后。線蟲腸道細(xì)胞中存在棒狀結(jié)晶體,代謝速度緩慢。感染前后沙鼠的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果沒有明顯變化,胃組織切片未見明顯的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲能在沙鼠胃內(nèi)發(fā)育但與羊體內(nèi)生長(zhǎng)速度相比明顯緩慢,是否能模擬羊早期感染的狀態(tài)還待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。綜上所述,本研究調(diào)查了中國(guó)部分地區(qū)羊胃腸道寄生蟲病的流行病學(xué)和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；分析了綿羊T淋巴細(xì)胞應(yīng)對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的差異基因表達(dá)譜和免疫應(yīng)答方式,一定程度上闡明了宿主的分子免疫應(yīng)答規(guī)律；利用線蟲-細(xì)胞體外共培養(yǎng)系統(tǒng)和沙鼠感染模型研究了宿主的早期免疫反應(yīng)。本研究將為探明宿主針對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的免疫應(yīng)答機(jī)制奠定良好基礎(chǔ),為制定有效的免疫防治策略提供重要參考。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S855.9
【目錄】：

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3 顧小龍;;羊混合感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和美麗筒線蟲的診治[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理專業(yè)委員會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

4 嚴(yán)若峰;李祥瑞;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

5 楊怡;周前進(jìn);閆寶龍;陳學(xué)秋;張紅麗;杜愛芳;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染誘導(dǎo)宿主T淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

6 王瑞;楊曉野;劉鑫遠(yuǎn);曲娜;蔡葵蒸;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐苯并咪唑蟲株與敏感蟲株P(guān)-gp基因的比較分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

7 段麗君;周前進(jìn);閆寶龍;楊怡;張紅麗;杜愛芳;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗候選抗原H11亞型的部分基因結(jié)構(gòu)比較分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

8 李鏑銳;汪明;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11基因胞外區(qū)段在畢赤酵母中的表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

9 嚴(yán)若峰;CharlesI．Muleke;徐立新;李祥瑞;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲組織蛋白酶B家族新成員-HC58基因的克隆與特性分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

10 王瑞;楊曉野;王辰君;劉鑫遠(yuǎn);蔡葵蒸;;耐伊維菌素捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株與敏感蟲株P(guān)-糖蛋白基因分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張洪讓 韋有奎;[N];中國(guó)畜牧報(bào);2004年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊怡;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染誘導(dǎo)的宿主T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 閆峰賓;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲免疫蛋白組和比較蛋白組研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

3 孫延鳴;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素生物學(xué)功能研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

4 易道生;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆、表達(dá)與生物學(xué)特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 Charles Inyagwa Muleke;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC58 cDNA基因的分子克隆和功能特性的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

6 韓凱凱;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA疫苗的免疫保護(hù)作用與烯醇化酶特性的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 周前進(jìn);利用秀麗隱桿線蟲表達(dá)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11蛋白的轉(zhuǎn)基因研究[D];浙江大學(xué);2010年

8 嚴(yán)若峰;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11抗原cDNA基因克隆、表達(dá)及山羊免疫保護(hù)性試驗(yàn)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

9 薄新文;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲BZ抗性等位基因多重PCR檢測(cè)及新基因Hc38的克隆、表達(dá)與特性分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

10 李法財(cái);捻轉(zhuǎn)血矛線蟲胰島素樣信號(hào)傳導(dǎo)通路重要基因結(jié)構(gòu)與功能的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 葛程;基于SNP的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（H.contortus）遺傳多樣性分析及P-糖蛋白基因核苷酸差異位點(diǎn)篩選[D];上海師范大學(xué);2015年

2 王婧;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Galectin C端CRD差異氨基酸突變對(duì)其生物學(xué)活性的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

3 牛延萍;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲過(guò)氧化物酶基因的克隆和5種蛋白的抗原特性分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 蘇會(huì)敏;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因克隆、表達(dá)、酶活性分析及重組谷氨酸脫氫酶活性測(cè)定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 殷方媛;中國(guó)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲遺傳多樣性的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 張立武;重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素免疫山羊真胃細(xì)胞因子表達(dá)定位[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

7 趙媛媛;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體外培養(yǎng)條件優(yōu)化和H11蛋白提取及氨肽酶活性分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 王倩囡;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H15 ES抗原基因的原核表達(dá)及重組蛋白間接ELISA方法的建立[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 姜小磊;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ES15/ES24在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的表達(dá)特性研究[D];浙江大學(xué);2010年

10 張平;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因在畢赤酵母中的表達(dá)及生物學(xué)特性初探[D];石河子大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染誘導(dǎo)的宿主T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：212123