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  本文關鍵詞：芘和萘單克隆抗體的制備及免疫檢測技術的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學》 2015年

芘和萘單克隆抗體的制備及免疫檢測技術的研究

孟星宇  

【摘要】：多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）是一類由2個及2個以上苯環(huán)或戊環(huán)構成的多環(huán)類碳氫化合物的總稱，是一類重要的環(huán)境和食品污染物，在大氣、水、土壤等環(huán)境中普遍存在。有研究顯示，PAHs可引發(fā)胃癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等疾病，同時破壞免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)，并導致內(nèi)分泌紊亂。動物實驗表明，PAHs可誘發(fā)多種癌癥，并造成機體的損傷。由于PAHs對人和動物危害較大，并且普遍存在于環(huán)境當中，已越來越多地受到人們的重視。因此，開展對PAH快速檢測技術研究尤為重要。目前，常見的檢測方法包括細胞檢測法、薄層掃描法、分光光度法、氣象色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、二極管矩陣檢測法等。但是應用儀器分析和細胞檢測方法需要較復雜的前期處理、較高的成本以及技術性較強專業(yè)人員，不利于檢測方法的推廣應用。而免疫學檢測方法擁有特異性強，靈敏度高，操作簡便，成本低等優(yōu)點，可迅速對大量實際樣品進行檢測。本研究在制備芘和萘的免疫抗原、檢測抗原和單克隆抗體基礎上，分別建立了芘和萘的間接競爭ELISA方法、膠體金免疫層析方法、免疫熒光定量PCR方法（Real-time immuno-PCR，RT-IPCR）和改進型RT-IPCR方法，為快速檢測PAHs含量奠定基礎。 本文應用活脂法，將半抗原芘和萘分別連接至載體蛋白，制備檢測抗原OVA-芘、OVA-萘和免疫抗原BSA-芘、BSA-萘，應用非變性凝膠電泳和紫外全波長掃描法鑒定偶聯(lián)成功。將免疫抗原免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾細胞、腘淋巴結細胞和Sp2/0細胞融合，篩選雜交瘤細胞，獲得2株可分泌芘單克隆抗體和萘單克隆抗體的雜交瘤細胞株。芘單克隆抗體和萘單克隆抗體亞型分別為IgG1和IgG3，親和力常數(shù)分別為3.23×109L/mol和4.17×108L/mol，效價分別為1：2.56×106和1：3.2×105。 利用制備的芘和萘的單克隆抗體，分別建立相應的間接競爭ELISA檢測方法，同時對檢測方法進行條件優(yōu)化。芘間接競爭ELISA最低檢測限為65.08pg/mL，檢測范圍為117.16pg/mL～3986.97pg/mL，實際樣品平均回收率為98.7±1.3%。萘間接競爭ELISA最低檢測限為2.0ng/mL，檢測范圍為3.78ng/mL～172.33ng/mL，實際樣品平均回收率為96.1±1.8%。 制備直徑為20nm的膠體金溶液，分別于芘和萘的單克隆抗體偶聯(lián)形成探針，透射電鏡和紫外全波長掃描結果顯示膠體金探針制備成功。組裝簡易試紙條后對各項參數(shù)進行優(yōu)化。芘試紙條裸眼檢測范圍為10ng/mL～50ng/mL，萘試紙條檢測范圍為25ng/mL～125ng/mL，，在4℃真空干燥條件下，試紙條至少可以穩(wěn)定保存8周。實際水樣品加標回收實驗表明，制備的膠體金試紙條性質穩(wěn)定，可應用于實際樣品。 利用芘和萘單克隆抗體，分別建立相應的免疫熒光定量PCR檢測方法，同時對條件進行優(yōu)化。芘RT-IPCR檢測范圍為100fg/mL～1ng/mL，實際樣品平均回收率為98.6±4.1%。萘RT-IPCR檢測范圍為10pg/mL～10ng/mL，實際樣品平均回收率為96.7±6.4%。 利用芘和萘單克隆抗體，分別建立相應的改進型RT-IPCR檢測方法，同時對條件進行優(yōu)化。芘改進型RT-IPCR檢測范圍為1pg/mL～1ng/mL，實際樣品平均回收率為96.9±4.8%。萘改進型RT-IPCR檢測范圍為100pg/mL～100ng/mL，實際樣品平均回收率為97.4±4.9%。 利用氣譜-質譜聯(lián)用法（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）分別建立萘、茐、菲、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[a]芘和茚并[1,2,3, cd]芘的標準曲線，確定最低檢測限，將獲得結果與前述建立的免疫學方法進行比較分析。結果表明，與GC-MS法相比，間接競爭ELISA法、RT-IPCR法、改進型RT-IPCR法靈敏度提高數(shù)十倍至數(shù)千倍。 綜上所述，本文制備了芘和萘的單克隆抗體，并分別建立了間接競爭ELISA法、膠體金試紙條法、RT-IPCR法和改進型RT-IPCR法。同傳統(tǒng)的GC-MS法相比，成本較低，靈敏度有不同程度的提高，可針對不同檢測要求，選擇應用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4
【目錄】：

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