本文關鍵詞：狂犬病病毒樣顆粒的構(gòu)建、制備及免疫效果評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學》 2015年

狂犬病病毒樣顆粒的構(gòu)建、制備及免疫效果評價

齊瑛琳  

【摘要】：狂犬病是重要的人獸共患傳染病，包括人在內(nèi)幾乎所有哺乳動物均易感�？袢≡诔^150個國家和地區(qū)發(fā)生，每年致超過5500人死亡，95%人類死亡病例發(fā)生在非洲和亞洲，這些地區(qū)犬類狂犬病潛在威脅超過30億人�？袢∮煽袢〔《荆╮abies virus, RABV）感染所致，RABV具嗜神經(jīng)性，感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病死率近乎100%�？袢∈且呙缈煞揽氐募膊�，預防人類狂犬病最為經(jīng)濟有效的策略就是通過疫苗免疫消除犬狂犬病，大部分發(fā)達國家，通過犬只大規(guī)模疫苗接種消除了犬狂犬病，進而顯著降低人類狂犬病發(fā)病數(shù)。因此，安全、有效、經(jīng)濟適用的狂犬病疫苗是十分重要的。 病毒樣顆粒（virus-like particle, VLP）是由病毒的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白在體外以自主裝配方式形成的一種粒子，形態(tài)和結(jié)構(gòu)上模擬天然病毒，不含遺傳物質(zhì)，無感染和復制能力。VLP以正確構(gòu)象和高度重復的形式展示抗原表位，具有良好免疫原性，同時誘導體液和細胞免疫，為宿主提供抵御病原微生物感染的能力。VLP已成為眾多病原微生物新型疫苗的研究熱點，流感VLP疫苗、乙型肝炎VLP疫苗等已進入臨床試驗或批準上市。但目前為止，有關狂犬病病毒樣顆粒（rabies VLP）構(gòu)建研究的報道卻是極少的。因此，本論文利用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)構(gòu)建生產(chǎn)rabies VLP，并對其免疫原性進行研究。 第一章：狂犬病病毒樣顆粒的構(gòu)建與制備。RABV糖蛋白（glycoprotein, GP）是唯一刺激并誘導機體產(chǎn)生病毒中和抗體（virus neutralizing antibody, VNA）的結(jié)構(gòu)蛋白，基質(zhì)蛋白（matrix protein, MP）決定了RABV合成、出芽，維持病毒形態(tài)，且MP上具有GP專一性結(jié)合位點，影響GP在病毒包膜表面的構(gòu)象。因此，本研究選擇RABVEvelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）株GP和MP作為構(gòu)建rabies VLP基本組裝元件。構(gòu)建并拯救分別表達GP和MP的重組桿狀病毒（recombinant baculovirus, rBV），共感染懸浮培養(yǎng)Sf9細胞，收獲上清并經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化rabies VLP。電鏡觀察可見大小在180~200nm、纖突明顯的圓形或橢圓形rabies VLP，Western Blot分析顯示rabies VLP由GP和MP組成，免疫電鏡檢測證實rabies VLP表面纖突為GP。成功構(gòu)建并生產(chǎn)出由RABVERA株GP和MP裝配形成的rabies VLP，命名為EVLP。 第二章：嵌合型狂犬病病毒樣顆粒的構(gòu)建與制備。鞭毛蛋白（flagellin）作為Toll樣受體（toll-like receptor, TLR5）5天然激動劑，有效誘導天然免疫，觸發(fā)B細胞和T細胞參與的適應性免疫。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基（LTB）與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1高度親和，增強抗原提呈能力，誘導淋巴細胞增殖與分化，提高機體免疫應答。因此，本研究選擇flagellin和LTB作為rabies VLP膜錨定形式的分子佐劑。分別構(gòu)建含GP跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)的flagellin和LTB融合基因，拯救分別表達flagellin和LTB融合基因的兩株rBV，并以分別表達GP、MP和flagellin或LTB的三種rBV共感染懸浮培養(yǎng)Sf9細胞，收獲上清并蔗糖密度梯度離心純化兩種嵌合型rabies VLP。電鏡觀察可見大小在180~200nm、纖突明顯的圓形或橢圓形嵌合型rabies VLP，，Western Blot分析顯示兩種嵌合型rabies VLP由GP、MP和flagellin或LTB組成，免疫電鏡檢測證實flagellin和LTB分別成功插入兩種嵌合型rabies VLP。成功構(gòu)建并生產(chǎn)出由RABV ERA株GP、MP和flagellin或LTB裝配形成的兩種嵌合型rabies VLP，分別命名為EVLP-F和EVLP-L。 第三章：狂犬病病毒樣顆粒免疫效果評價。通過肌肉注射免疫小鼠和犬，評價EVLP、EVLP-F和EVLP-L免疫效果以及是否具有開發(fā)成新型狂犬病疫苗的潛能。小鼠免疫顯示，三種rabies VLPs均具有免疫原性，但與EVLP相比，EVLP-F和EVLP-L誘導更快更強的VNA反應，觸發(fā)顯著增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T細胞；兩種嵌合型rabies VLP免疫后在腹股溝淋巴結(jié)募集和/或活化更多的B細胞和樹突狀細胞（dendritic cell, DC）；EVLP-F誘導產(chǎn)生強大的特異性IgG2a抗體反應，活化傾向于Th1型免疫應答；與之相反，EVLP-L觸發(fā)更傾向于IgG1血清抗體反應；EVLP免疫僅保護部分小鼠免受RABV致死性攻擊，而EVLP-F和EVLP-L所誘導顯著增強的體液和細胞免疫應答為小鼠提供完全保護用于抵抗RABV感染。更為重要的是，與EVLP相比，EVLP-F和EVLP-L同樣在犬體內(nèi)誘生更高的VNA滴度及顯著增強的外周血淋巴細胞IFN-γ和IL-4分泌反應，并保護所有免疫犬在RABV致死性攻擊中存活。三種rabies VLP均具有免疫原性，但膜錨定形式flagellin和LTB在嵌合型rabiesVLP中發(fā)揮強大的佐劑活性，與EVLP相比，EVLP-F和EVLP-L在小鼠和犬體內(nèi)均誘導產(chǎn)生顯著增強的RABV特異性體液和細胞免疫反應，并保護免疫動物遠離RABV感染。因此，rabies VLP具有開發(fā)成為安全有效的新型動物用狂犬病疫苗的潛能。 第四章：板藍根多糖對狂犬病病毒樣顆粒免疫原性的影響。佐劑是疫苗的重要組成部分，能提高抗原免疫原性，誘導增強型免疫應答反應。中草藥中一種主要的生物活性成分為多糖，具有廣泛藥理學活性，特別是在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用上。IIP-A-1是一種從傳統(tǒng)中草藥板藍根中提取純化的α-葡聚糖。本研究將EVLP聯(lián)合IIP-A-1作為抗原，肌肉注射免疫小鼠，詳細分析其誘導的免疫反應，并進一步評估IIP-A-1佐劑活性及是否具有開發(fā)成為新型佐劑用于VLP或其他抗原的潛力。與單一EVLP免疫相比，EVLP聯(lián)合IIP-A-1共免疫顯著增強先天性和適應性免疫應答反應，包括B細胞和DC募集和/或活化，T淋巴細胞增殖和活化，分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T細胞分化，RABV特異性VNA產(chǎn)生；此外，低劑量EVLP混合IIP-A-1后能觸發(fā)與單一高劑量EVLP誘導產(chǎn)生的相似強度的免疫應答反應；更為重要的是，EVLP聯(lián)合IIP-A-1誘導的顯著增強的免疫反應能完全保護免疫小鼠抵抗RABV致死性攻擊。結(jié)果暗示板藍根提取物α-葡聚糖IIP-A-1具有明顯的免疫增強活性，具有開發(fā)成為新型佐劑的特性，用于VLP疫苗或其他類型疫苗。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

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