發(fā)布時間：2018-06-24 13:47

  本文選題：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 + 紅霉素　； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學院》2016年博士論文

【摘要】：長時間大規(guī)模使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素將產(chǎn)生風險。為了對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行有效及時監(jiān)管,需要發(fā)展各種檢測方法構(gòu)成完善的檢測方法網(wǎng)絡(luò)。目前市場上大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測方法有多種,但各種方法均存在相應(yīng)不足。利用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素調(diào)控蛋白MphR(A)或MphR(E)與特異雙鏈DNA序列的結(jié)合-解離作用,可以建立類似酶聯(lián)免疫法的類ELISA系統(tǒng),以檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素物質(zhì)。這種系統(tǒng)的優(yōu)點是可檢測多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。目前已有利用MphR(A)蛋白建立的體內(nèi)外檢測系統(tǒng)文獻報道,但尚無以MphR(E)蛋白建立的檢測系統(tǒng)報道。為了進一步研究以調(diào)控蛋白-DNA相互作用為基礎(chǔ)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測系統(tǒng),本實驗以類ELISA方法為手段,以Mph R(A)及其DNA相互作用為模板,對比研究MphR(A)和MphR(E)蛋白及與蛋白相互作用的DNA序列。本實驗的基本路線是將合成的MphR(A)和Mph R(E)蛋白基因分別構(gòu)建到表達載體pET28b(+),在大腸桿菌BL21(DE3)中表達MphR(A)和MphR(E)蛋白,然后用純化蛋白建立大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測的類ELISA系統(tǒng)。本實驗比較了MphR(A)和Mph R(E)蛋白建立的類ELISA系統(tǒng)對各種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的識別特異性。結(jié)果表明,各種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在以MphR(A)和MphR(E)蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)中反應(yīng)特性一致。但在目前的反應(yīng)體系下,Mph R(A)蛋白比MphR(E)蛋白性能更優(yōu)異。本研究確認Mph R(A)蛋白和MphR(E)蛋白不僅能夠和自身對應(yīng)的DNA序列結(jié)合,也可以和對方對應(yīng)的DNA序列結(jié)合,且兩個蛋白和DNA結(jié)合的特性接近。比較對應(yīng)三段DNA序列,發(fā)現(xiàn)三段DNA序列均含有一段22bp長的不完全回文結(jié)構(gòu)。通過實驗基本確定這些不完全回文結(jié)構(gòu)為蛋白結(jié)合的核心序列。采用不同的DNA序列構(gòu)建系統(tǒng),系統(tǒng)靈敏度有差異。用A-DNA或B-DNA構(gòu)建系統(tǒng)的IC50為6.72±2.49 ng/mL(n=10),用C-DNA構(gòu)建系統(tǒng)的IC50為3.95±1.18 ng/mL(n=10),而用AC4-DNA構(gòu)建系統(tǒng)的IC50為2.33±0.70 ng/mL(n=7)。B-DNA的不完全回文序列(B5-DNA)和C-DNA的不完全回文序列(C6-DNA)用作系統(tǒng)中反應(yīng)的DNA時,系統(tǒng)需要的蛋白濃度很高,而且系統(tǒng)背景值高,不合適目前體系下的類ELISA系統(tǒng)。根據(jù)類ELISA結(jié)果,推測蛋白和DNA的結(jié)合力對類ELISA系統(tǒng)靈敏度有影響,即在一定蛋白濃度范圍內(nèi),蛋白和DNA結(jié)合力越低,系統(tǒng)靈敏度越高。采用生物膜干涉技術(shù)(BLI)初步測定了A-DNA、B-DNA、C-DNA、AC4-DNA與MphR(A)蛋白的親和常數(shù)。結(jié)果表明A-DNA、B-DNA、AC4-DNA和蛋白的親和力接近,C-DNA和蛋白的親和常數(shù)較前三個DNA的低近一個數(shù)量級。利用MphR(A)和A-DNA作基礎(chǔ),采用蛋白和抗生素藥物分步反應(yīng)的方式,建立了原奶中紅霉素殘留的類ELISA系統(tǒng)。根據(jù)中國和歐盟殘留限量規(guī)定計算所得系統(tǒng)的CCα值為43.28ng/mL,CCβ值為46.44ng/mL。該系統(tǒng)基本滿足原奶實測樣本需求,但要作為實際應(yīng)用產(chǎn)品,還需要對該方法進一步研究,提高系統(tǒng)穩(wěn)定性。
[Abstract]:MphR ( A ) and Mph R ( E ) proteins have been used to detect macrolide antibiotics .
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S859.8

【相似文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 程永友;基于受體蛋白MphR（A和E）的類ELISA構(gòu)建及在大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測的初步應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

，

本文編號：2061725