本文選題：重新分類 + PCR��； 參考：《蘭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：沙打旺(Astragalus adsurgens)是我國特有豆科牧草,適宜于干旱、半干旱和半荒漠地區(qū),具有治理水土流失等生態(tài)作用。沙打旺黃矮根腐病是由沙打旺埃里磚格孢(Embellisia astragali)引致的沙打旺上最重要的病害之一,為系統(tǒng)性病害、氣傳病害和種傳病害。此前研究表明該病菌的形態(tài)特征及在寄主體內(nèi)的生活特性與瘋草內(nèi)生真菌(Alternaria spp.=Undifilum spp.,Embellisa spp.)相似,但由于尚未見其分子生物學(xué)方面的報道,故二者相似的論斷尚缺少分子生物學(xué)的佐證。為減少種子傳播途徑和分子育種,減少病害的發(fā)生,有必要研制出種帶該病菌的快速檢測技術(shù),以及挖掘出其致病基因。為此,本論文開展了相關(guān)研究,得到如下主要結(jié)果。1.基于3-磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)、RNA聚合酶II第二大亞基(RPB2)和轉(zhuǎn)錄延伸因子1-α(TEF-1)的聯(lián)合多基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,確定該病菌與鏈格孢屬波浪芽管孢組Genus Alternaria Section Undifilum的模式種A.bornmuelleri DAOM 231361均屬于同一組;基于核糖體編碼基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和GPD多基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,顯示該病菌與6種瘋草中的4種瘋草內(nèi)生真菌不同,屬另一物種,兩個系統(tǒng)樹中上述兩個分支的MP自展支持率和貝葉斯后檢支持率都分別為100%和1.00;再加上此菌也具有鏈格孢屬波浪芽管孢組典型形態(tài)特征“波浪芽管”,鑒于種加詞“astragali”已被其他真菌占用。故將其更名為甘肅鏈格孢Alternaria gansuense comb.nov.,厘清了沙打旺黃矮根腐病菌與瘋草內(nèi)生真菌之間的關(guān)系。2.根據(jù)細(xì)胞質(zhì)膜三磷酸腺苷水解酶基因片段(ATPase)設(shè)計出此菌的特異性檢測引物AatpF(GTCGAGAGTTTTTTCTT)和AatpR(GGTGGAGCTGGGTTGTTTTA),利用此特異引物進(jìn)行普通PCR,可檢測出沙打旺種子中5 pg/μL以上的此病菌DNA,帶菌率1.5%的種子;熒光定量PCR擬合方程為Ct=-3.226×(log[DNA])+29.055,相關(guān)系數(shù)為0.9987,最低可以檢測0.5 pg/μL沙打旺黃矮根腐病菌DNA。運用本方法可以準(zhǔn)確快速檢驗檢疫沙打旺種帶黃矮根腐病菌,預(yù)防該病在新建植人工栽培沙打旺草地致病成災(zāi)。3.根據(jù)線粒體內(nèi)核糖體小亞基編碼基因(mtSSU)基因設(shè)計出瘋草內(nèi)生真菌特異性檢測引物OmtssuF(CATAGAAAAAAAAATAAACAAACTG)和OmtssuR(TGTCTGCCCAGGTTACGG),利用此特異引物進(jìn)行普通PCR檢測,最低檢測瘋草樣品中含5 pg/μL內(nèi)生真菌DNA,熒光定量PCR擬合方程為Ct= 2.9105*(log[DNA])+31.213,相關(guān)系數(shù)為0.9973,最低檢測限為5 fg/μL瘋草內(nèi)生真菌DNA。該方法可以應(yīng)用于揭示瘋草中內(nèi)生真菌含量與有毒物質(zhì)苦馬豆素含量之間的關(guān)系研究中。4.以基因組DNA為模板,采用真菌鈣調(diào)素保守區(qū)兼并引物CAL-228F和CAL-737R擴增得539 bp的同源片段;采用Hi-TAIL PCR分別獲得344 bp的5’側(cè)翼序列和729 bp的3’側(cè)翼序列,拼接獲得基因的1290 bp的全長DNA序列;利用全長引物CaMF和CaMR,得到840 bp的DNA全長序列和450 bp的cDNA全長序列,DNA全長序列中有4個內(nèi)含子,均具有典型的AT-AG特征,cDNA全長序列翻譯出149氨基酸多肽,與其他真菌的鈣調(diào)素高度同源。再次采用Hi-TAIL PCR技術(shù)克隆鈣調(diào)素基因5′端992 bp和3′端1096 bp的側(cè)翼序列,在此基礎(chǔ)上,用Split-Marker技術(shù),構(gòu)建了沙打旺黃矮根腐病菌鈣調(diào)素基因的敲除載體,為后續(xù)闡明其調(diào)控該菌生物學(xué)功能、致病性機制奠定基礎(chǔ)。5.將液體搖瓶培養(yǎng)15天的沙打旺黃矮根腐病菌菌絲為材料,以0.6 M MgSO4為穩(wěn)滲劑,20 mg/mL Glucanex+20 mg/mL Glucanase+20 mg/mL纖維素酶+0.16 UN/mL幾丁質(zhì)酶復(fù)配,30℃,120 rpm水浴振蕩酶解6 h,四層擦鏡紙-漏斗法過濾收集原生質(zhì)體。先液體后固體,自然涂布法于RM培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)15~20天可再生,為后續(xù)開展REMI遺傳轉(zhuǎn)化建立突變體庫及基因敲除奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Astragalus adsurgens is endemic in China . It is suitable for arid , semi - arid and semi - desert areas . It is one of the most important diseases caused by Embellisia spp . In order to reduce the propagation and molecular breeding of seeds and to reduce the occurrence of diseases , it is necessary to develop a rapid detection technique with the pathogen and a phylogenetic tree constructed by combining multiple genes of transcription extension factor 1 - 偽 ( TEF - 1 ) . ,鍘樻竻浜嗘矙鎵撴椇榛勭煯鏍硅厫鐥呰弻涓庣柉鑽夊唴鐢熺湡鑿屼箣闂寸殑鍏崇郴.2.鏍規(guī)嵁緇嗚優(yōu)璐ㄨ啘涓夌７閰歌吅鑻鋒按瑙ｉ叾鍩哄洜鐗囨(ATPase)璁捐鍑烘鑿岀殑鐗瑰紓鎬ф嫻嬪紩鐗〢atpF(GTCGAGAGTTTTTTCTT)鍜孉atpR(GGTGGAGCTGGGTTGTTTTA),鍒╃敤姝ょ壒寮傚紩鐗╄繘琛屾櫘閫歅CR,鍙嫻嬪嚭娌欐墦鏃虹瀛愪腑5 pg/渭L浠ヤ笂鐨勬鐥呰弻DNA,甯﹁弻鐜，

本文編號：2055700