由白粉病菌(Podosphera pannosa)引起的白粉病害(Powdery mildew)是全球切花月季(Rosa hybrida)生產(chǎn)的第一大病害,也是庭院月季和盆花月季的主要病害之一。中國是全球薔薇野生資源的分布中心之一,也是全球切花月季的主產(chǎn)區(qū)之一,但是對薔薇野生資源的優(yōu)異性狀或基因缺乏研究,從而制約了該類資源在現(xiàn)代月季遺傳改良中的應用。Mlo基因是一類新發(fā)現(xiàn)的抗病基因,一些雙子葉植物(如擬南芥、豌豆、番茄)隱形突變的Mlo基因讓其獲得了廣譜高抗的抗病性。本研究以野薔薇(又稱多花薔薇)(R.multiflora)及其雜交后代為研究材料,通過同源克隆法從中獲得4個Mlo的全長c DNA和genomic DNA序列,再采用相關分析軟件對這4個目的基因進行結構分析;然后以BC1(2n=2x)分離群體為材料,采用遺傳連鎖圖譜技術對4個候選基因進行定位分析;而后利用實時熒光定量q PCR技術分析4個目的基因的時空表達規(guī)律;最后構建候選基因Rh MLO1的正義表達載體和反義抑制載體,分別轉(zhuǎn)化‘白玉’材料并獲得轉(zhuǎn)基因植株,比較轉(zhuǎn)基因植株與對照植株白粉病抗性上的差異,從“得”和“失”兩個角度以及正反兩面去驗證該基因在月季中的功能。本研究獲得的結果和主要結論如下:1四個月季Mlo基因的克隆與序列分析以野薔薇及其雜交后代為材料,采用RT-PCR和RACE等技術克隆得到四個月季白粉病抗病候選基因的c DNA和g DNA全長序列,分別命名為Rh MLO1-Rh MLO4。Rh MLO1-Rh MLO4四個基因的c DNA全長分別為1779 bp、1767 bp、1692 bp和1695 bp,它們的最大開放閱讀框分別編碼592、588、563和564個氨基酸。其編碼蛋白均包含7個跨膜結構域及兩個典型的MLO模體結構,即Calmodulin-binding-site(Ca MBD)和C末端的D/E-F-S/T-F結構域。Rh MLO1-Rh MLO4的蛋白分子量分別為67.79 k Da、67.22 k Da、64.55 k Da和64.61 k Da,理論等電點分別為9.53、8.96、9.00和9.26。Rh MLO1-Rh MLO4四個基因的基因組序列長度分別為6.1 kb、3.7 kb、9.3 kb和3.5 kb,序列分析顯示這四個基因均包含15個外顯子和14個內(nèi)含子。上述研究結果說明Rh MLO1-Rh MLO4四個基因是Mlo基因家族的新成員,同時也為進一步研究這四個基因的結構和功能奠定了基礎。用該四個基因所編碼的蛋白序列與其他作物MLO蛋白序列進行比對,結果表明:月季的MLO序列與擬南芥、番茄、豌豆等雙子葉植物的同源關系更近,與大麥、小麥、水稻和玉米等單子葉植物的親緣關系更遠,這一結果與植物學傳統(tǒng)分類系統(tǒng)一致。2四個月季Mlo基因的遺傳連鎖圖譜構建通過PCR-SSCP技術,利用Join Map2.0軟件構建了四個Mlo基因的遺傳連鎖圖譜。結果表明:Rh MLO1基因定位在5號連鎖群NBS104-3_1與CAg-ATg355-3_1兩標記之間,Rh MLO2基因定位在3號連鎖群上并與重瓣花相關基因Blfo的遺傳距離較近,Rh MLO3和Rh MLO4基因緊密連鎖并定位在1號連鎖群上,該區(qū)域附近有月季黑斑病抗性相關基因和白粉病抗性相關數(shù)量性狀基因。這四個Mlo基因的定位結果將對我們下一步利用分子標記輔助育種的實踐工作具有重要的指導意義。3四個月季Mlo基因的時空表達分析利用實時熒光定量PCR技術,對四個目的基因進行了時空表達分析。實驗結果表明:Rh MLO1和Rh MLO2基因在不同組織部位及不同脅迫中的表達模式趨于一致,兩者在不同脅迫下均表現(xiàn)為積極響應誘導上調(diào),并且在受白粉病菌侵染的不同階段均表現(xiàn)為表達量明顯上調(diào)趨勢。因此,Rh MLO1和Rh MLO2基因有可能在月季與白粉病菌互作的過程中扮演著重要角色。4候選基因Rh MLO1的功能驗證通過酶切和連接等步驟,分別構建了月季Rh MLO1基因的正義表達載體和反義抑制表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導法分別對‘白玉’植株材料的體細胞胚進行遺傳轉(zhuǎn)化。利用PCR法和FQ-PCR法對轉(zhuǎn)基因植株進行檢測,結果表明目的基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組之中。分別利用離體鑒定法和顯微鏡觀察法對轉(zhuǎn)基因植株和對照植物進行白粉病抗性鑒定,兩種方法顯示的結果一致:正義載體的導入使轉(zhuǎn)基因植株白粉病抗性降低;反義載體的導入使轉(zhuǎn)基因植株白粉病抗性增強。該實驗結果說明Rh MLO1基因在月季與白粉病菌互作的過程中發(fā)揮著重要作用。

【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S685.12
【目錄】：

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本文編號：204309