本文關(guān)鍵詞：枳兩個(gè)基因PtrABF和PtrCDPK轉(zhuǎn)化枳的抗逆功能及其作用機(jī)制解析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

枳兩個(gè)基因PtrABF和PtrCDPK轉(zhuǎn)化枳的抗逆功能及其作用機(jī)制解析

張慶華  

【摘要】：柑橘在生長發(fā)育的過程中易受到各種逆境脅迫,因此會(huì)對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生影響。為解決這些問題必須加強(qiáng)培育抗性強(qiáng)的柑橘品種。傳統(tǒng)的育種手段對(duì)于果樹育種來說,需要的周期長,局限性較大,而隨著基因工程技術(shù)的應(yīng)用,將一些具有抗性的基因轉(zhuǎn)入柑橘中將加快柑橘育種的進(jìn)程。枳(Poncirus trifoliata)是柑橘中廣泛應(yīng)用的砧木之一,具有較強(qiáng)的抗寒性。已有研究表明,ABF和CDPK能被逆境誘導(dǎo)表達(dá),參與逆境響應(yīng)調(diào)控。本研究利用超表達(dá)Ptr ABF和Ptr CDPK早實(shí)枳,進(jìn)一步分析了它們的基因功能及其作用機(jī)理,研究結(jié)果如下:1、對(duì)Ptr ABF基因轉(zhuǎn)早實(shí)枳株系進(jìn)行PCR鑒定,獲得6株陽性轉(zhuǎn)基因植株。Ptr ABF基因在#8和#10株系中超量表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因株系較野生型有較強(qiáng)的抗脫水能力。掃描電鏡觀測顯示轉(zhuǎn)基因植株的氣孔密度和開度較野生型降低。RT-PCR顯示氣孔發(fā)育相關(guān)基因SPCH、FAMA和MUTE在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量下降。Ptr ICE1是氣孔發(fā)育的關(guān)鍵基因,利用酵母雙雜交和Bi FC技術(shù)表明Ptr ABF能與Ptr ICE1互作。對(duì)正常條件下的野生型和#10系進(jìn)行基因芯片雜交,共挑選出70個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)表達(dá)42個(gè),下調(diào)表達(dá)28個(gè)。隨機(jī)挑選了10個(gè)上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證與芯片結(jié)果一致。在上調(diào)表達(dá)的42個(gè)差異基因中,33個(gè)差異基因有功能注釋。并分析了33個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異基因的啟動(dòng)子中的ABREs(ABA-responsive elements)和CEs(coupling elements)順式作用元件。33個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異基因中,大部分啟動(dòng)子中僅包括ABREs、CEs或二者的組合式順式作用元件,只有5個(gè)不含有ABREs或CEs順式作用元件。基因芯片分析顯示,Pt POD和Pt ADC的轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)基因系(#10和#8)中表達(dá)高于野生型(WT)。酵母單雜交和瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了Ptr ABF能與Pt ADC和Pt POD啟動(dòng)子互作。轉(zhuǎn)基因系中POD酶活性在脫水處理前后是野生型的大約2倍,脫水處理后,在轉(zhuǎn)基因株系中POD、CAT、SOD酶活性均高于野生型,此結(jié)果與其基因表達(dá)量一致。ROS結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因葉片中H2O2和O2-的含量均顯著低于野生型,與DAB和NBT的染色結(jié)果一致。此外,轉(zhuǎn)基因系中MDA含量顯著低于野生型,與較低ROS積累結(jié)果一致。正常生長條件下的轉(zhuǎn)基因系中的自由態(tài)多胺(腐胺、精胺、亞精胺)均高于野生型。不同濃度的D-arg(ADC抑制劑)預(yù)處理轉(zhuǎn)基因株系,脫水處理后,轉(zhuǎn)基因株系中H2O2和O2-的積累和含量隨著D-arg濃度的增加而增加。不同濃度的雙胍辛胺乙酸鹽預(yù)處理后再進(jìn)行脫水處理,結(jié)果顯示,隨著雙胍辛胺乙酸鹽濃度的增加,轉(zhuǎn)基因系中H2O2的積累較野生型少,且轉(zhuǎn)基因株系中抗氧化物酶的基因表達(dá)和酶活性也比野生型降低。2、Ptr CDPK編碼一類絲氨酸/蘇氨酸激酶,開放讀碼框含有1676bp堿基,編碼558個(gè)氨基酸,該蛋白的分子量為63.25 k Da,等電點(diǎn)為8.26。Ptr CDPK的催化區(qū)含有1個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)合區(qū)和調(diào)控區(qū)含有4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)鈣結(jié)合區(qū),氨基酸比對(duì)顯示與其他物種的相似性較高。與擬南芥CDPK家族進(jìn)行進(jìn)化樹分析顯示Ptr CDPK被劃分為第III族成員。Ptr CDPK能響應(yīng)多種脅迫如ABA、干旱、鹽等,并定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。對(duì)Ptr CDPK基因轉(zhuǎn)早實(shí)枳株系進(jìn)行PCR鑒定,獲得4株陽性轉(zhuǎn)基因植株。Ptr CDPK基因在#34和#36株系中超量表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物具有較強(qiáng)的抗脫水能力,轉(zhuǎn)基因植物的相對(duì)失水率、電導(dǎo)率、MDA含量均低于野生型。轉(zhuǎn)基因株系積累較少的ROS,且測定的抗氧化酶的活性及其酶的基因表達(dá)量均高于野生型。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SOD、POD和CAT基因中含有多個(gè)CDPK可磷酸化位點(diǎn),包括Ser、Thr、Try。綜上所述,Ptr CDPK可能通過磷酸化抗氧化酶的方式提高ROS的清除提高轉(zhuǎn)基因株系的抗脫水能力。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S666
【目錄】：

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9 楊居祥;大鼠精子發(fā)生中階段差異表達(dá)基因的分離、表達(dá)及初步功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2000年

10 鐘其旺;幾種鲆鰈魚類Myostatin基因的克隆及結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析[D];中國海洋大學(xué);2007年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉術(shù)金;橡膠樹膠乳中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆及其表達(dá)特性研究[D];海南大學(xué);2010年

2 李江;基于Disease Ontology的疾病相似性和基因相似性研究[D];哈爾濱醫(yī)科大學(xué);2011年

3 唐娟;梨蔗糖與磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆、序列分析及特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

4 王智宇;睪丸新基因的克隆及其在隱睪模型中的表達(dá)分析[D];華中科技大學(xué);2008年

5 甘進(jìn)鋒;幾丁質(zhì)酶抑制活性蛋白酶基因和類胡蘿卜素結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)家蠶表達(dá)研究[D];西南大學(xué);2009年

6 黃彥;利用Lotka-Volterra方程構(gòu)建小腦組織發(fā)育中基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

7 王俊;個(gè)人免費(fèi)基因檢測項(xiàng)目的商業(yè)模式案例研究[D];云南大學(xué);2013年

8 宋緒華;小鼠18S rRNA基因在卵巢和卵母細(xì)胞中的表達(dá)及其RNAi載體構(gòu)建[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

9 張?zhí)m男;初發(fā)nonM3CN-AML患者EVI1基因高表達(dá)提示預(yù)后不良[D];華中科技大學(xué);2013年

10 耿微;利用FOX hunting system技術(shù)篩選堿茅中與脅迫相關(guān)基因[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：枳兩個(gè)基因PtrABF和PtrCDPK轉(zhuǎn)化枳的抗逆功能及其作用機(jī)制解析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：202016