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  本文關(guān)鍵詞：西洋參中人參皂苷相關(guān)功能基因的鑒定分析與表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

西洋參中人參皂苷相關(guān)功能基因的鑒定分析與表達(dá)研究

王樂  

【摘要】：西洋參是一種名貴的多年生草本植物，具有美容養(yǎng)顏、抗疲勞、抗衰老等功效。人參皂苷是西洋參中行使其藥理學(xué)活性功能的主要代謝產(chǎn)物。研究表明達(dá)瑪烷型人參皂苷為人參皂苷的主要成分，且達(dá)瑪烯二醇合成酶(DS)、細(xì)胞色素氧化酶P450中的原人參二醇合成酶(D12H)與原人參三醇合成酶(P6H)在達(dá)瑪烷型人參皂苷的合成途徑中起關(guān)鍵作用。前體物質(zhì)2,3-氧化角鯊烯在DS的催化作用下生成達(dá)瑪烯二醇，經(jīng)D12H的C-12羥基化作用生成原人參二醇，再由P6H在C-6的羥基化作用合成原人參三醇。原人參二醇與原人參三醇可以在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下形成最終的單體皂苷。西洋參中的原人參二醇合成酶基因(PqD12H)的鑒定分析工作已由本課題組完成，而達(dá)瑪烯二醇合成酶基因以及原人參三醇合成酶基因的研究工作還沒有具體報(bào)道。 本研究從西洋參中達(dá)瑪烯二醇合成酶基因與原人參三醇合成酶基因的克隆鑒定入手，完成了基因的克隆、序列分析、異源表達(dá)鑒定、異源共表達(dá)分析和超表達(dá)調(diào)控研究等工作。完善了對(duì)西洋參中人參皂苷生物合成途徑的研究，為人參皂苷的異源合成奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)西洋參中人參皂苷合成的表達(dá)調(diào)控及種質(zhì)創(chuàng)新具有一定的參考價(jià)值。主要研究結(jié)果如下： 1.根據(jù)已發(fā)表的人參與三七中的達(dá)瑪烯二醇合成酶基因、原人參三醇合成酶基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，，利用RACE技術(shù)成功的獲得了西洋參中的達(dá)瑪烯二醇合成酶基因與原人參三醇合成酶基因的全長(zhǎng)序列，經(jīng)生物信息學(xué)方法分析后分別命名為PqDS與CYP6H，并已注冊(cè)GenBank獲得檢索號(hào)，分別為KC316048與KC190491。 2.將PqDS與CYP6H的開放閱讀框序列克隆擴(kuò)增，利用酶切連接技術(shù)構(gòu)建各自的異源表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中分別進(jìn)行異源表達(dá)鑒定。提取菌液代謝物進(jìn)行高效液相檢測(cè)，結(jié)果表明兩個(gè)基因均能成功的異源表達(dá)具有活性功能的蛋白酶。 3.分別構(gòu)建基因PqDS、PqD12H與CYP6H的異源表達(dá)載體pAUR123-PqDS、pAUR123-PqD12H與pAUR123-CYP6H，然后以釀酒酵母菌作為受體菌，按順序分階段的將各重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入同一釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建異源共表達(dá)工程菌yeast-pAUR123-PqDS-PqD12H-CYP6H。提取菌液代謝物進(jìn)行高效液相檢測(cè)，結(jié)果表明基因PqDS、PqD12H與CYP6H可以在釀酒酵母菌中異源共表達(dá)合成原人參三醇，并且產(chǎn)量可以達(dá)到13.85μg/g FW。 4.此外，還利用酶切連接技術(shù)構(gòu)建了基因PqDS與CYP6H的超表達(dá)載體pBI121-PqDS與pBI121-CYP6H，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)的發(fā)根農(nóng)桿菌A4形成各自的超表達(dá)工程菌A4-pBI121-PqDS與A4-pBI121-CYP6H，經(jīng)侵染西洋參根片誘導(dǎo)形成超表達(dá)發(fā)根系后，檢測(cè)總皂苷及達(dá)瑪烷型單體皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的含量變化用以分析基因PqDS與CYP6H的超表達(dá)對(duì)皂苷合成的表達(dá)調(diào)控作用。結(jié)果表明PqDS的超表達(dá)使各種單體皂苷的含量有15.44%-46.55%不同程度的增加，并使總皂苷含量增加24.56%；基因CYP6H的超表達(dá)會(huì)提高原人參三醇型皂苷的含量17.80%-19.9%不等，與此同時(shí)減少原人參二醇型皂苷的含量4.46%-11.26%，并且使總皂苷的含量增加9.24%。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S567.53
【目錄】：

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6 張旭;宋鳳瑞;劉志強(qiáng);劉淑瑩;;不同方法提取人參皂苷的電噴霧質(zhì)譜研究[A];中國(guó)有機(jī)質(zhì)譜學(xué)第十三屆全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2005年

7 王玉珠;薛燕;陳霽;張均田;;人參皂苷Rg_1及其代謝產(chǎn)物腦內(nèi)分布的研究[A];第八次全國(guó)藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

8 朱玲英;唐雨德;沈紅;徐金娣;金鑫;李松林;;超高壓處理對(duì)鮮人參微生物及人參皂苷含量的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥分析分會(huì)第五屆學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2012年

9 王曉波;王亞楠;劉丹;襲榮剛;;耐力膠囊中西洋參人參皂苷Rg_1人參皂苷Re和人參皂苷Rb_1的含量測(cè)定[A];2012年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國(guó)藥師周論文集[C];2012年

10 呂圭源;葉合;陳素紅;樓招歡;;人參皂苷Rb1體內(nèi)分布及當(dāng)歸等中藥對(duì)人參皂苷吸收影響研究[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥實(shí)驗(yàn)藥理分會(huì)第八屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2009年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王雪飛;[N];健康報(bào);2004年

2 仇逸;[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2008年

3 李 春;[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

4 傅俊英;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

5 本報(bào)記者　倪迅;[N];光明日?qǐng)?bào);2003年

6 陳玉婷;[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

7 李韶菁;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

8 白毅;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2008年

9 陸 靜;[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2004年

10 本報(bào)記者 王鵬飛;[N];威海日?qǐng)?bào);2012年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李緒文;人參皂苷降解及其產(chǎn)物化學(xué)成分的研究[D];吉林大學(xué);2006年

2 趙文杰;創(chuàng)新抗癌藥物20（S）-人參皂苷Rg3的研究[D];吉林大學(xué);2009年

3 李英博;人參皂苷誘導(dǎo)人神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的機(jī)制研究以及在缺血缺氧和蛛網(wǎng)膜下腔出血誘導(dǎo)的腦損傷中的應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

4 弓曉杰;人參皂苷酶代謝產(chǎn)物化學(xué)修飾及其抗癌活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

5 馬成俊;半合成稀有人參皂苷及抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2005年

6 周英武;人參皂苷Rg1對(duì)樹突狀細(xì)胞效應(yīng)與分子機(jī)制的研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

7 王魯;人參皂苷硫酸化修飾及其免疫活性的研究[D];吉林大學(xué);2007年

8 陳立敏;人參皂苷Re基于多靶點(diǎn)理論的抗阿爾茨海默病作用研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2008年

9 劉繼華;具有抗癌活性人參皂苷的結(jié)構(gòu)修飾研究[D];吉林大學(xué);2008年

10 褚秀玲;分子修飾前后的人參皂苷抗馬立克氏病毒的作用及其機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2007年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李微;人參皂苷的結(jié)構(gòu)修飾及生物活性的研究[D];吉林大學(xué);2010年

2 郝成欣;人參皂苷Rb1在小鼠體內(nèi)分布研究[D];東北師范大學(xué);2010年

3 米佳寧;集成化擴(kuò)張床原位提取和分離人參皂苷的方法研究[D];華東理工大學(xué);2012年

4 劉敏;纖維素、淀粉、氨基酸對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

5 盧秀花;人參皂苷Re對(duì)心肌缺血再灌注損傷及線粒體凋亡通路影響的研究[D];吉林大學(xué);2009年

6 劉微;人參皂苷Rb_1對(duì)染鉛小鼠骨鉛含量及行為記憶的影響[D];延邊大學(xué);2010年

7 胡蔣寧;人參皂苷及七葉皂苷抗肥胖活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

8 劉欣;人參皂苷Rb_1水解酶的分離純化及其性質(zhì)的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2003年

9 孫麗;人參皂苷A注射在健康人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2008年

10 姜紅柳;人參皂苷Re對(duì)老年性癡呆小鼠的治療作用及機(jī)制探討[D];吉林大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：西洋參中人參皂苷相關(guān)功能基因的鑒定分析與表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：201469