本文選題：哈薩克馬 + 發(fā)育��； 參考：《石河子大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：隨著新疆現(xiàn)代馬業(yè)的興起,哈薩克馬作為珍貴的地方馬品種資源應(yīng)予以保護(hù)。已知哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞在一些減數(shù)分裂基因表達(dá)調(diào)控下進(jìn)行發(fā)育和分化,睪丸內(nèi)大量基因的表達(dá)是受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的控制。miRNA是一類(lèi)非編碼的小分子RNA,在真核生物基因組中,它們調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生的某些關(guān)鍵步驟中必需依靠miRNAs分子調(diào)控,近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的研究分析了在不同物種睪丸不同發(fā)育階段miRNA表達(dá)譜的差異性,但是對(duì)于馬睪丸miRNA表達(dá)譜的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為了解哈薩克馬不同發(fā)育階睪丸組織形態(tài)特點(diǎn),不同階段馬睪丸組織中miRNAs的鑒定與差異表達(dá)情況,以及miR-34家族在馬不同組織中的表達(dá)規(guī)律,本研究是在前人的研究基礎(chǔ)上,共采集馬駒,周歲馬,3歲以上共計(jì)26匹馬的睪丸組織,測(cè)量并記錄完整睪丸組織的長(zhǎng)度、周長(zhǎng)、年齡、編號(hào)等數(shù)據(jù);采用石蠟切片技術(shù)制備所有樣品的組織切片(HE染色和卡紅染色),每個(gè)組織切片挑選30個(gè)正圓或接近正圓形的曲精細(xì)管,測(cè)量其直徑,統(tǒng)計(jì)曲靜細(xì)管內(nèi)不同種類(lèi)生殖細(xì)胞的數(shù)量。根據(jù)組織切片的結(jié)果,確定需要對(duì)馬駒,周歲馬和5歲以上馬睪丸組織測(cè)序。從馬睪丸內(nèi)提取RNA,然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用Solexa高通量測(cè)序,將clean序列在馬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI Genebank和Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定miRNA;對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行功能注視(GO分析和KEGG分析)。運(yùn)用熒光定量PCR的方法對(duì)馬睪丸、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、骨骼肌和脂肪組織中的miR-34家族表達(dá)規(guī)律進(jìn)行分析研究,得出以下研究結(jié)果:1.哈薩克馬駒到成年馬的發(fā)育過(guò)程中,睪丸逐漸變大,3歲馬睪丸的寬度和長(zhǎng)度顯著小于成年馬(p0.05)。3歲馬曲精細(xì)管的直徑和細(xì)管內(nèi)的精子數(shù)也小于成年馬,精子細(xì)胞數(shù)之間沒(méi)有顯著差異,哈薩克馬幼駒的曲精細(xì)管尚未發(fā)育完整,周歲馬的曲精細(xì)管已經(jīng)形成,睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多,3歲公馬生殖細(xì)胞種類(lèi)完整,但精子細(xì)胞和精子數(shù)量較少;5-12歲馬生殖細(xì)胞種類(lèi)完全,精子細(xì)胞和精子數(shù)目較多。2.在三個(gè)文庫(kù)分別得到了9250474(馬駒),9820184(周歲馬),和9813836(公馬)原始序列馬駒和周歲馬文庫(kù)中的短鏈RNA呈現(xiàn)正太分布,在21-23nt有一個(gè)高峰,對(duì)應(yīng)miRNAs的表達(dá);成年馬文庫(kù)為雙峰分布,在22-23nt有一個(gè)強(qiáng)峰,在25-27nt有一個(gè)弱峰,分別對(duì)應(yīng)miRNAs和piRNAs。馬駒、周歲馬和公馬文庫(kù)中分別發(fā)現(xiàn)了375個(gè),391個(gè)和388個(gè)已知和保守的miRNAs,發(fā)現(xiàn)了47個(gè),111個(gè),和78個(gè)novel miRNAs。根據(jù)睪丸發(fā)育三個(gè)階段的miRNA差異分析,miRNA被分為9組,其中constant-up組含有48個(gè)miRNAs,包括4個(gè)已經(jīng)被驗(yàn)證的與精子發(fā)生最為相關(guān)的miRNAs:miR-34b,miR-34c,miR-449a和miR-449b。GO和KEGG pathway分析表明,constant-up組與細(xì)胞增殖和癌癥有關(guān)。3.miR-34a在馬駒的肝臟、肺臟和成年公馬的脾臟呈現(xiàn)高表達(dá),在馬駒,周歲馬和成年公馬的睪丸,成年公馬的肺臟、腎臟以及馬駒的腎臟和心臟內(nèi)適度表達(dá),在馬的肌肉和脂肪內(nèi)表達(dá)量均較低;miR-34b在馬駒肺臟呈高表達(dá),在成年馬的脾臟、腎臟,睪丸和肺臟和馬駒腎臟一般表達(dá),在心臟、肝臟、脂肪和肌肉表達(dá)量均較低;miR-34C在馬駒肺臟高表達(dá),在成年馬的脾臟、腎臟、肺臟,睪丸和馬駒肝臟和腎臟一般表達(dá),在心臟、肌肉和脂肪內(nèi)表達(dá)量均較低。miR-34a在所有發(fā)育階段馬睪丸內(nèi)相對(duì)表達(dá)量較為穩(wěn)定,miR-34b和miR-34c在成年馬階段出現(xiàn)明顯上升,成年馬miR-34b和miR-34c表達(dá)量與馬駒和周歲馬表達(dá)量有極顯著的差異(p0.01)。馬的miR-34家族在5’端有相同的“種子序列”(GGCAGUG)。miR-34a與miR-34b和miR-34c分別具有86%和82%的同源性。數(shù)據(jù)顯示miR-34b和miR-34c在馬體內(nèi)多個(gè)組織有相似的表達(dá)模式。分析上述結(jié)果本研究得出如下結(jié)論:1.在哈薩克的發(fā)育過(guò)程中,5月齡馬(馬駒)的睪丸還未發(fā)育,有睪丸索;1.5歲馬(周歲馬)睪丸的曲靜細(xì)管正在發(fā)育,沒(méi)有精子發(fā)生;3歲馬的曲靜細(xì)管發(fā)育完全,但睪丸直徑,曲靜細(xì)管內(nèi)的精子細(xì)胞和精子略微小于發(fā)育完全的公馬;5歲以上馬(成年馬)曲靜細(xì)管發(fā)育完全內(nèi)各類(lèi)生殖細(xì)胞多,表明生殖功能活躍。2.在三個(gè)文庫(kù)中,本研究發(fā)現(xiàn)了459個(gè)已知和保守的miRNA,其中馬駒文庫(kù)有375個(gè),周歲馬文庫(kù)有391個(gè),公馬文庫(kù)有388個(gè);piRNA(25nt、26nt、27nt)在公馬(成熟)睪丸中表達(dá)量超過(guò)短鏈文庫(kù)中的三分之一,與精子發(fā)生和減數(shù)分裂密切相關(guān),本文預(yù)測(cè)睪丸組織中的piRNA很可能是今后動(dòng)物生殖發(fā)育的一個(gè)熱點(diǎn)。3.在馬發(fā)育過(guò)程中miR-34a在多種組織中廣泛表達(dá),而miR-34b和miR-34c的表達(dá)具有明顯的組織特異性;miR-34b的表達(dá)變化曲線與miR-34c的變化曲線基本平行;位于同一基因簇上的miR-34b和miR-34c具有極為類(lèi)似的表達(dá)模式和分子結(jié)構(gòu),本研究分析認(rèn)為馬的miR-34b和miR-34c也具有冗余功能。
[Abstract]:The expression of miR - 34 family in testis , heart , liver , spleen , lung , kidney , skeletal muscle and adipose tissue of horse testis , heart , liver , spleen , lung , kidney , skeletal muscle and adipose tissue was studied by using paraffin section technique . The expression of miR - 34b , miR - 34c , miR - 449a and miR - 449b . The expression of miR - 34b and miR - 34c is very similar to that of miR - 34c , and miR - 34b and miR - 34c have a very similar expression pattern and molecular structure .
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S821
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本文編號(hào)：2008600