本文選題：蘋果 + GA20-ox基因�。� 參考：《沈陽農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：蘋果(Malus domestica Borkh.)是世界范圍內(nèi)栽培最為廣泛、經(jīng)濟價值較高的果樹樹種之一。本研究以RNAi為沉默目的基因的關鍵技術,將編碼GA20-ox基因的沉默信號用農(nóng)桿菌介導法導入蘋果當中,用以阻斷GA的生物合成從而獲得轉(zhuǎn)基因矮化砧木,探討基于系統(tǒng)獲得性沉默原理利用轉(zhuǎn)基因蘋果砧木改良非轉(zhuǎn)基因蘋果接穗的可行性。具體研究結(jié)果如下：1.以平邑甜茶種胚為外植體,在篩選出適合的胚培養(yǎng)培養(yǎng)基的情況下建立了繼代增殖體系、組培苗生根體系和組培微嫁接體系。較適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+1 mg·L_(-1) 6-BA +0.1 mg·L_(-1) NAA+0.2 mg.L_(-1)GA,在此培養(yǎng)基上增殖系數(shù)為3.37。適于平邑甜茶生根的培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.6 mg·L_(-1) IBA+0.5 g·L_(-1) AC,生根率為69.67%。最適于微嫁接的培養(yǎng)基是MS+0.3 mg·L_(-1) IAA+1.0 mg.L_(-1)BA,接穗和砧木均選用繼代培養(yǎng)40 d的試管苗,并且接穗具有2片真葉時嫁接成活率最高,用平邑甜茶作為砧木的嫁接成活率高,嫁接口愈合最好。2.建立了平邑甜茶組培苗葉片為外植體離體再生不定芽體系。最適宜的培養(yǎng)基是MS+4.0 mg·L_(-1)6-BA+0.40 mg·L_(-1)NAA;近軸面與培養(yǎng)基接觸的葉片再生不定芽頻率高于遠軸面與培養(yǎng)基接觸的葉片再生不定芽頻率；暗培養(yǎng)對葉片再生不定芽是必需的,暗培養(yǎng)21 d左右能明顯提高葉片的再生效率；選擇繼代培養(yǎng)四周的葉色嫩綠有光澤、長勢較強的組培苗葉片為外植體,可以顯著提高蘋果離體葉片的再生頻率；再生植株在添加25mg·L_(-1)Kan培養(yǎng)30 d時,再生植株葉片出現(xiàn)白化,40 d葉片枯萎死亡；培養(yǎng)基中添加0.5mg·L_(-1)GA時,能顯著提高組培苗的伸長生長趨勢。3.根據(jù)GenBank中登陸的蘋果GA20-ox基因的序列,依照基因的同源性設計引物擴增寒富蘋果基因組DNA,獲得一條466 bp的片段,并命名為MdGA20-ox;經(jīng)分析此片在不同基因型蘋果中序列一致,以pKANNNBAL載體為中間載體,利用Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ/Xba Ⅰ分別進行雙酶切,將MdGA20-ox插入連接到pKANNNBAL上,然后利用Not I單酶切,并與pART27載體連接,最終構(gòu)建成RNA干擾載體pRNAi-GA20ox。4.利用農(nóng)桿菌介導法將pRNAi-GA20ox導入寒富和平邑甜茶中來沉默GA20-ox基因,轉(zhuǎn)化試驗共獲得寒富轉(zhuǎn)基因系5株,平邑甜茶轉(zhuǎn)基因系3株。由于GA20-ox基因表達受到抑制,轉(zhuǎn)基因系的的莖和節(jié)間長度變短,植株高度低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?其中植株高度最矮的是T-HF_2,相當于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?7%,節(jié)數(shù)是對照的1.3倍 (4.3/3.4)節(jié)間長度0.44 cm；另外轉(zhuǎn)基因系的增殖率都有所提高,這些結(jié)果表明GA20-ox在控制植株營養(yǎng)生長中具有重要作用。試驗也嘗試用GA3外源噴施田間苗,結(jié)果轉(zhuǎn)基因系都恢了普通生長型。用非轉(zhuǎn)基因系嘎啦為接穗(GL),植株高度最矮、節(jié)間最短的轉(zhuǎn)基因系寒富(T-HF_2)和平邑甜茶(T-PT_3)為砧木的微嫁接研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因砧木是可以影響接穗生長的,如GL/T-HF_2 (1.50 cm)伸長長度雖接近于GL/HF (1.44 cm),但節(jié)間數(shù)(4.53)和節(jié)間長度(0.63 cm)均顯著高于GL/HF (3.00,1.00 cm),而對照GL/T-PT_3為植株節(jié)間數(shù)4.83,節(jié)間長度0.61 cm。從表型變化來看,接穗高度GL/HFGL/T-HF_2GL/T-PT_3。
[Abstract]:Malus domestica Borkh. is one of the most widely cultivated and economically valuable fruit tree species in the world. This study takes RNAi as the key technique of the silent target gene, and introduces the silent signal of the GA20-ox gene into Apple by Agrobacterium mediated method to block the biosynthesis of GA and obtain the transgenic dwarf rootstock. The feasibility of Using Transgenic Apple Rootstock to improve non transgenic apple scion based on the principle of system acquired silence was discussed. The specific results are as follows: 1. the subculture system, the rooting system of tissue culture seedlings and the tissue culture micro grafting system have been established with the suitable embryo culture medium as the explants in the case of the suitable embryo culture medium. 1. The more suitable proliferation medium is MS+1 mg. L_ (-1) 6-BA +0.1 mg. L_ (-1) NAA+0.2 mg.L_ (-1). BA, scion and rootstock were all subculture 40 d test tube seedlings, and when the scion had 2 true leaves, the grafting survival rate was the highest, the grafting survival rate was high with Pingyi sweet tea as the rootstock, and the best.2. of the marrying interface was established to build the regeneration adventitious bud system of the tissue cultured leaves of Pingyi sweet tea. The most suitable medium was MS+4.0 mg. L_ (-1). 6-BA+0.40 mg. L_ (-1) NAA; the frequency of adventitious buds regenerated from the leaves in contact with the medium is higher than that of the leaves from the culture medium. The dark culture is necessary for the regenerated adventitious buds of the leaves. The regeneration efficiency of the leaves can be obviously improved by the dark culture of 21 d, and the green and glossy leaf color of the selected subculture leaves is bright and glossy. The regeneration frequency of the leaves could be significantly increased by the leaves of strong growing tissue culture seedlings. When the regenerated plants were adding 25mg. L_ (-1) Kan for 30 d, the leaves of the regenerated plants were whitened and 40 d leaves withered and died. When 0.5mg. L_ (-1) GA was added to the medium, the elongation trend of the tissue culture seedlings could be significantly increased according to GenB. The sequence of the apple GA20-ox gene which was landed in ank was designed to amplify the genomic DNA of cold rich apple according to the homology of the gene. A fragment of 466 BP was obtained and named MdGA20-ox. After analyzing the sequence in different genotype apples, the pKANNNBAL vector was used as the intermediate carrier, and Xho I /EcoR I and Hind III /Xba I were used respectively. Double enzyme cut, insert MdGA20-ox into pKANNNBAL, then use Not I single enzyme to cut, and connect with pART27 carrier, and finally construct RNA interference carrier pRNAi-GA20ox.4. using Agrobacterium mediated method to transfer pRNAi-GA20ox into cold rich and Pingyi sweet tea to silence GA20-ox gene. Transformation test obtained 5 transgenic lines of cold rich, Pingyi sweet 3 strains of tea transgenic lines. Because of the inhibition of GA20-ox gene expression, the stem and internode length of the transgenic lines were shorter and the height of the plant was lower than that of the non transgenic control. The height of the plant was T-HF_2, equivalent to 57% of the non transgenic control, and the number of nodes was 1.3 times (4.3/3.4) of the internode length of 0.44 cm, and the proliferation rate of the transgenic lines was both. These results suggest that GA20-ox plays an important role in controlling the growth of plant nutrition. The experiment also tried to spray the field seedlings with GA3, and the transgenic lines were restored to the common growth type. The transgenic line was GL, the height of the plant was the shortest, the shortest internode was T-HF_2 and T-PT_3 (T-PT_3). The results of the rootstock micro grafting showed that the transgenic rootstock could affect the growth of the scion, for example, the length of GL/T-HF_2 (1.50 cm) was close to GL/HF (1.44 cm), but the number of internodes (4.53) and internode length (0.63 cm) were significantly higher than GL/HF (3.00,1.00 cm), while the number of plants was 4.83, and the length of internode 0.61 cm. changed from phenotypic variation. Look, the height of the scion is GL/HFGL/T-HF_2GL/T-PT_3.
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S661.1

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本文編號：2003402