本文選題：橘小實蠅 + 腸道微生物��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：腸道微生物與宿主之間存在著廣泛的非致病關(guān)系,腸道共生微生物影響著宿主的生長發(fā)育、能量代謝、有害物質(zhì)降解、免疫防御系統(tǒng)成熟等。如大部分后生動物一樣,昆蟲腸道上皮細胞無時無刻不與微生物接觸,其種類從有益的共生菌、非共生菌、隨食物進入的微生物到影響宿主生命的病原菌。在這樣一種復(fù)雜的環(huán)境中,為了實現(xiàn)防御腸道病原微生物的同時又能維持共生微生物穩(wěn)定的目的,宿主腸道上皮細胞必須在免疫應(yīng)激和免疫耐受之間保持一種穩(wěn)態(tài)平衡。Duox-ROS免疫系統(tǒng)和免疫缺陷(immune deficiency,Imd)信號通路作為腸道免疫反應(yīng)的基本途徑,必然參與調(diào)節(jié)此過程,然而人們對于宿主如何通過腸道免疫機制來維持其腸道微生物菌群穩(wěn)態(tài)以保持其功能的分子機理尚不清楚。本研究以橘小實蠅為研究對象,利用RNAi、qRT-PCR和Illumina MiSeq細菌16S rDNA高通量測序等分子生物學(xué)手段研究BdDuox基因在宿主腸道免疫及腸道細菌群落穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控中的重要作用;ROS對宿主生理功能的影響;闡述Imd信號通路在宿主免疫防御中的作用。1 Duox-ROS系統(tǒng)在腸道免疫和細菌群落穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用通過克隆獲取橘小實蠅雙氧化酶(dual oxidase,BdDuox)基因編碼區(qū)核酸序列長度4584bp,該基因編碼1528個氨基酸,BdDuox蛋白具有7次跨膜結(jié)構(gòu),擁有典型的過氧化物酶結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)Duox-ROS防御系統(tǒng)在橘小實蠅腸道免疫防御中發(fā)揮著重要作用,橘小實蠅取食大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌6h和12h后,腸道BdDuox基因表達量和ROS水平顯著上調(diào);而取食腸道共生菌6h后,除次要菌群蠟樣芽孢桿菌能夠顯著誘導(dǎo)BdDuox基因表達量和ROS水平顯著上升外,其余5種腸道主要菌群均不能引起B(yǎng)dDuox基因的免疫響應(yīng),Duox-ROS免疫防御系統(tǒng)清除病原菌同時耐受腸道共生菌。注射BdDuox dsRNA后的1-7天,BdDuox基因表達量下調(diào)了26-54%,腸道ROS水平下降31-44%;注射BdDuox dsRNA后的9-17天,BdDuox基因上調(diào)了1.40-1.68倍,腸道ROS水平增加45-73%;而注射BdDuox dsRNA后的第20天,ds-duox干擾組BdDuox基因表達量和腸道ROS水平恢復(fù)到和ds-egfp對照組相一致水平。注射BdDuox dsRNA后的第5天和15天,橘小實蠅腸道細菌菌群密度分別增加了1.68和1.49倍,其中腸道主要菌群Enterobacteriaceae和Leuconostocaceae相對比例顯著下降,Bacillaceae、Bacteroidaceae、Verrucomicrobiaceae等次要菌群相對比例顯著增加,致使腸道細菌群落穩(wěn)態(tài)紊亂;紊亂的腸道細菌群落反過來刺激宿主腸道上調(diào)表達BdDuox基因水平,介導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生來抑制次要菌群的過量增殖,最終在Duox-ROS系統(tǒng)調(diào)控下恢復(fù)腸道細菌群落穩(wěn)態(tài)平衡。以上結(jié)果表明BdDuox基因在橘小實蠅腸道細菌群落穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。2 ROS對橘小實蠅成蟲生理功能的影響通過RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)BdCatalase基因在橘小實蠅腸道氧化還原平衡維持、成蟲生殖力和壽命中具有重要作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射BdCat dsRNA后的1-7天,相比于對照組,BdCat基因顯著下調(diào)了54.04-75.42%,而ds-cat干擾組腸道ROS水平上升了1.37-1.62倍;注射BdCat dsRNA后的第5天和10天,ds-cat干擾組腸道總細菌菌群密度分別下降了33.91%和34.78%。通過RNAi沉默BdDuox和BdCat基因研究ROS對宿主壽命的影響實驗中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BdDuox和BdCat基因的沉默均不會影響宿主的平均壽命和總存活時間,但BdCat基因的沉默會延長宿主的中位生存期(Median survival time)。另外,本研究發(fā)現(xiàn)BdCat基因的沉默所造成的ROS水平上升會顯著降低宿主的產(chǎn)卵量和卵孵化率,ds-cat干擾組雌蟲在BdCat基因沉默后14-20天,單頭雌蟲日均產(chǎn)卵量下降了31.01-57.09%,ds-cat干擾組卵孵化率下降了25.45%;而BdDuxo基因的沉默所導(dǎo)致的ROS下降卻對宿主產(chǎn)卵量和卵孵化率無顯著影響。而通過喂食橘小實蠅化學(xué)物質(zhì)研究ROS對宿主壽命的影響實驗中,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橘小實蠅取食百草枯和維生素C后7天,供試蟲體全部死亡,兩種化學(xué)物質(zhì)喂食所導(dǎo)致的ROS上升和下降大大降低了宿主壽命。3橘小實蠅IMD信號通路免疫防御功能研究通過對橘小實蠅進行條件致病菌注射和喂食感染,研究Imd信號通路在宿主系統(tǒng)和腸道免疫反應(yīng)中的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DH5α注射侵染后會迅速激活I(lǐng)md信號通路系統(tǒng)免疫反應(yīng),BdDiptericin、BdRelish、BdPGRP-LB、BdPGRP-SB基因表達水平顯著上調(diào),而BdPGRP-SC2基因表達量在注射后的3-12h顯著下調(diào)了55.63-90.73%。大腸桿菌DH5α短期喂食感染只能夠誘導(dǎo)腸道Duox-ROS免疫系統(tǒng)的免疫響應(yīng),以及腸道Imd信號通路關(guān)鍵因子BdRel基因和BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的免疫響應(yīng)。在大腸桿菌DH5α喂食感染后的3-12h,BdDuox基因表達量顯著上調(diào)了1.70-2.89倍,卻不能誘導(dǎo)Imd信號通路效應(yīng)基因BdDpt的上調(diào)表達。在對PGRPs家族基因功能的研究中,我們發(fā)現(xiàn)BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因在橘小實蠅Imd信號通路中具有重要負(fù)調(diào)控作用,BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的沉默會導(dǎo)致Imd信號通路對大腸桿菌DH5α出現(xiàn)過激免疫響應(yīng)。在大腸桿菌DH5α長期連續(xù)喂食感染生測實驗中,我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DH5α喂食感染的6h和12h只誘導(dǎo)Duox-ROS免疫系統(tǒng)的免疫響應(yīng),不能激活腸道Imd信號通路的免疫反應(yīng),與短期喂食感染結(jié)果相類似;而在大腸桿菌DH5α喂食感染后的第3天,能夠激活腸道Imd信號通路強烈免疫響應(yīng),大腸桿菌DH5α喂食后3-15天,腸道BdDpt基因上調(diào)了10.50-26.95倍;但腸道Duxo-ROS免疫系統(tǒng)在3-15天處于靜默狀態(tài),這些結(jié)果說明腸道Imd信號通路與Duox-ROS兩條信號的免疫響應(yīng)存在時序差異。另外,大腸桿菌DH5α的長期喂食能夠誘導(dǎo)脂肪體中BdDpt基因的上調(diào)表達,大腸桿菌DH5α喂食后的5-15天,脂肪體中的BdDpt基因同樣出現(xiàn)上調(diào)了4.08-7.25倍,且H2O2和百草枯的喂食所導(dǎo)致的腸道內(nèi)ROS水平的增加能夠提前誘導(dǎo)腸道IMD信號通路對大腸桿菌DH5α的免疫響應(yīng),表明ROS在腸道Duox-ROS免疫防御系統(tǒng)和Imd免疫信號通路免疫互作中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:In order to protect intestinal pathogenic microorganisms and to maintain the stability of symbiotic microorganisms , the expression of BdDuox gene and immune deficiency ( Imd ) signal pathway in intestinal immunity and intestinal bacterial community can be maintained stably . The results show that the Duox - ROS system plays an important role in the immune defense of intestinal flora . The results showed that the BdCatalase gene plays an important role in the steady regulation of intestinal bacterial community in the small intestine . The results showed that Bdduox gene plays an important role in the steady regulation of intestinal bacterial community in the small intestine . The results showed that the expression of BdPGRP - LB , BdPGRP - SB , BdPGRP - LB , BdPGRP - SB , BdPGRP - LB , BdPGRP - SB and BdPGRP - sc2 decreased significantly .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S433

【參考文獻】

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本文編號：1783685