本文關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的草魚腸道炎癥機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

錦鯉皰疹病毒減毒株的篩選及免疫原性的研究

劉建平  

【摘要】：錦鯉皰疹病毒(KHV),也稱為鯉科皰疹病毒3型(CyHV-3)或鯉魚鰓壞死和間質(zhì)性腎炎病毒(CNGV),是一種對(duì)鯉魚和錦鯉具有高度傳染性,高致命性的病原體。由該病毒感染引起的疾病稱為錦鯉皰疹病毒病。受錦鯉皰疹病毒病(KHVD)影響的魚塘死亡率有時(shí)會(huì)高達(dá)70-95%,該病在以色列大規(guī)模爆發(fā)并被首次報(bào)道,90年代初美國和歐洲等國陸續(xù)被該病困擾,近十多年來我國的鯉魚養(yǎng)殖業(yè)也受到嚴(yán)重威脅,這種高致病性疾病已迅速蔓延至世界各地的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。但是至今還未研制出針對(duì)該病的特效疫苗。本研究以減弱錦鯉皰疹病毒強(qiáng)毒株(KHV-CJ)的毒力為主線,用中草藥細(xì)葉桉葉來輔助減弱病毒毒力,加快KHV-CJ的毒力致弱,最后將獲得的減毒株對(duì)鯉魚進(jìn)行免疫試驗(yàn)以及攻毒試驗(yàn),來研究其免疫保護(hù)效果。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.桉液對(duì)細(xì)胞及病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制情況的影響。采用MTT法將不同濃度的桉液作用細(xì)胞,96h檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的毒性,設(shè)置6組不同的桉液濃度10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml的實(shí)驗(yàn)組和無藥物作用的對(duì)照組,在酶標(biāo)儀OD490nm處測(cè)量其吸光度,利用公式來計(jì)算其細(xì)胞存活率。在對(duì)細(xì)胞安全的濃度范圍下,通過觀察CPE和MTT來研究抑制KHV增殖復(fù)制的效果。結(jié)果表明:桉液濃度為0.2mg/ml和0.1mg/ml時(shí),作用于KF-1細(xì)胞,細(xì)胞存活率明顯高于其他稀釋濃度,因此桉液濃度為0.2mg/ml為最高細(xì)胞安全生長(zhǎng)濃度。在桉液濃度0.2mg/ml時(shí),對(duì)KHV的增殖復(fù)制有明顯的抑制作用。2.錦鯉皰疹病毒減毒株的篩選及免疫原性的研究。將KHV-CJ連續(xù)傳至52代,根據(jù)Reed-Muench兩氏法測(cè)定每代病毒的TCID50。把P3、P21、P52(TCID50效價(jià)為10-6.59;10-5.87;10-4.61),滅活病毒對(duì)照組和PBS對(duì)照組分別免疫接種于鯉魚,每免疫組免疫劑量為100TCID50,免疫注射于腹腔,在3周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后每隔7d進(jìn)行采血。利用ELISA方法檢測(cè)特異性抗體效價(jià),中和實(shí)驗(yàn)來測(cè)定中和抗體水平,加強(qiáng)免疫后三周設(shè)置攻毒組和對(duì)照組來測(cè)定免疫保護(hù)情況,并利用病理組織切片來驗(yàn)證減毒株的保護(hù)力。結(jié)果顯示:免疫注射P3組鯉魚死亡率達(dá)90%,毒株未致弱。免疫注射P21組的死亡率也有25%以上,說明毒株未被完全致弱;滅活病毒組的死亡率較低,僅有10%,而免疫注射P52組的全部存活,說明P52組免疫保護(hù)力較高。ELISA的結(jié)果表明P52組誘導(dǎo)的KHV特異性抗體高于滅活病毒對(duì)照組,而對(duì)照組卻未檢測(cè)出OD450值的變化。中和試驗(yàn)的結(jié)果表明,對(duì)照組鯉魚均沒有產(chǎn)生中和抗體,與ELISA結(jié)果相似,P52組產(chǎn)生的中和抗體水平高于滅活病毒組。通過攻毒試驗(yàn)的結(jié)果可以看出免疫組的保護(hù)率高于滅活病毒組。對(duì)病理切片的觀察,免疫組的組織未發(fā)生病理變化,滅活病毒組有部分組織發(fā)生病變,而對(duì)照組組織全部發(fā)生病理變化。說明本研究成功篩選出KHV的減毒株其對(duì)鯉魚有良好的保護(hù)力。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S943
【目錄】：

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