本文選題：水稻 + 免疫應答��； 參考：《浙江大學》2016年博士論文

【摘要】：轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻T51-1 (Tu et al.,2000)是一個結實率偏低和葉尖枯萎且葉色發(fā)黃的插入突變體,其旁側序列分析證實該插入突變體中的外源Bt基因是插入在一個水稻內(nèi)源類抗病基因Os10g0183000的啟動子中,并位于該基因起始.密碼子ATG上游797bp處(Lai et al.,2013)。由于T51-1相對原始非轉(zhuǎn)基因受體親本明恢63(MH63)最顯著的特征是低結實率,因此將該基因命名為OsLSR(Low seed setting rate)。本研究以MH63為材料克隆了該基因,通過反向遺傳學對OsLSR在水稻中的功能進行了分析和驗證,著重分析了該基因的表達特性,基因及其各個結構域的功能,亞細胞定位和積累特性,以及蛋白質(zhì)互作和信號傳導途徑。研究結果如下：(一) OsLSR的表達特性：實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)OsLSR在水稻各個組織包括根,莖,葉,葉鞘,節(jié),花中都有表達,且在水稻小花內(nèi)部器官包括雌蕊,雄蕊,漿片中表達水平較高。將OsLSR的啟動子連接GUS報告基因,進一步分析了該基因在水稻花序發(fā)育過程中的時空表達特性,發(fā)現(xiàn)其在水稻花發(fā)育過程中的表達涉及每一個器官而且具有明顯的時序特點：起先只在小花枝梗分叉處表達；繼而在雌蕊底部大量表達直至開花；隨著花器官的發(fā)育,在早期幼嫩花藥中高效表達,然后逐漸減弱消失；開花前,在花絲中的表達逐漸增強并達到峰值水平；臨開花時則在漿片中大量表達。OsLSR的這種表達特性,表明OsLSR在水稻花器官發(fā)育和開花過程中,扮演著非常重要的角色。(二) OsLSR在水稻中的功能：序列比對表明,OsLSR基因具有植物NLR基因的典型特征；熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)T51-1中OsLSR的表達量被上調(diào),且所檢測的免疫應答相關基因的表達量也出現(xiàn)了1.7-158倍不同程度的上升；將OsLSR在煙草中瞬時表達,誘導煙草細胞產(chǎn)生超敏反應；在水稻品種明恢63穩(wěn)定過量表達OsLSR,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)明顯的生長弱勢,且結實率顯著下降；這些結果證實OsLSR基因編碼細胞內(nèi)免疫受體NLR蛋白,而T51-1生長弱勢是由于OsLSR基因表達上調(diào)導致植株長期處于免疫激活狀態(tài)所致。當利用RNAi技術抑制該基因的表達后,陽性愈傷的根系再生和生長受阻,且形態(tài)發(fā)生異常；至生殖生長階段,部分分生組織確定性消失以致花器官分化發(fā)生紊亂；進一步通過過量表達OsLSR蛋白的不同功能域或片段,轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出不同程度的花發(fā)育缺陷；然而將OsLSR全長蛋白與核定位信號NLS和輸出信號NES融合以改變其在水稻細胞中的原有分布狀態(tài),同樣能引起花器官分化異常。這些結果因而進一步表明OsLSR基因參與了花器官的發(fā)育與分化。由此看來,OsLSR是一個既參與了水稻免疫反應調(diào)節(jié)又參與了其花器官發(fā)育與分化的基因。這是首次報道NLR蛋白影響水稻花器官建成的直接證據(jù),因此增進了人們對NLR類基因功能的認識。(三) OsLSR的亞細胞分布和免疫應答模式：前人的研究業(yè)已表明植物NLR蛋白的亞細胞分布對其行使功能有著重要的影響。對此采用兩種方法對OsLSR的亞細胞分布進行了研究。由于OsLSR蛋白的致死性,無法通過在煙草細胞的瞬時表達中來得到完整OsLSR蛋白的亞細胞分布。于是通過構建一系列OsLSR結構域截段和eGFPde融合表達載體,來研究它的亞細胞分布。結果發(fā)現(xiàn)LSR 1-178和LSR464-546兩個截段的eGFP融合蛋白均表現(xiàn)出依賴蛋白豐度的細胞分布特性,即在低豐度的細胞中,均定位于葉綠體中,而在高豐度表達的細胞中,前者表現(xiàn)為在葉綠體、細胞核和細胞質(zhì)中均有分布,而后者則只在細胞質(zhì)中積累。聯(lián)系到OsLSR蛋白的豐度與它的免疫激活程度有關,可以推斷,OsLSR低豐度表達時,不被激活的OsLSR蛋白位于葉綠體中；但當OsLSR表達增加,OsLSR蛋白被激活,并隨即從葉綠體轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)與細胞核中。進一步地,我們通過引入外源的核定位信號NLS和核輸出信號NES來改變OsLSR在核內(nèi)外的分布,以了解對其生物學功能有無影響。結果發(fā)現(xiàn)在煙草葉片中瞬時表達時,由于亞細胞積累特性的改變導致OsLSR誘導過敏性細胞死亡的能力減弱和NtPR1a表達水平降低；而在水稻中穩(wěn)定表達時發(fā)現(xiàn)引入核定位信號NLS的轉(zhuǎn)基因植株中的抗性標記基因的表達均高于引入核輸出信號NES的轉(zhuǎn)基因植株。另外,通過分析內(nèi)源OsLSR的轉(zhuǎn)錄水平,我們還發(fā)現(xiàn)LSR::eGFPHLS能充分抑制其轉(zhuǎn)錄。這些結果因此說明細胞核內(nèi)的OsLSR具有自身負反饋調(diào)解能力。由此看來,細胞質(zhì)與細胞核中積累的OsLSR都參與了免疫應答信號傳遞,其中細胞核中積累的OsLSR對于誘導免疫應答時的轉(zhuǎn)錄重編程至關重要,并對自身表達具有負反饋調(diào)節(jié)作用,以免過于激烈的自免疫反應造成自我傷害。(四) OsLSR對下游基因的調(diào)控特性：以LSR1-178為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交篩選水稻cDNA文庫,發(fā)現(xiàn)其與水稻亞硫酸鹽氧化酶OsSO,和金屬硫蛋白OsMT2b存在互作。通過實時熒光定量PCR檢測它們在oSLSR于擾和過表達株系中的表達水平,發(fā)現(xiàn)oSLSR對這兩個基因均是負調(diào)控。在oSLSR結構域超表植株中發(fā)現(xiàn)LSR1-178負責抑制作用,而LSR160-437和LSR464-894則促進了它們的表達。這與文獻報道的osSO和oSMT2b參與了植物的抗病以及細胞死亡結果相一致,并且這兩個基因表達異常均能阻礙水稻的生長發(fā)育。這些研究結果表明,oSLSR除了能誘導免疫應答和調(diào)控水稻小花分化外,還能通過調(diào)控oSMT2b和osSO的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境,使得它們保持一個正常的轉(zhuǎn)錄水平,維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。綜上所述,本項研究以T51-1及其受體親本MH63為材料,闡明了水稻基因osLSR對水稻生長發(fā)育和抵御病害的作用及機理,解釋了T51-1的生長弱勢的原因。本項研究將水稻免疫應答和小花分化這兩個過去被認為是相互獨立的生理生化過程,通過osLSR在分子水平上建立了聯(lián)系,拓寬了對NB-LRR蛋白功能的認知,為進一步交叉研究提供了新的啟發(fā)和思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S511

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;中國首先向世界公布水稻基因圖[J];中國稻米;2002年03期

2 江澤民;在國際水稻大會上的講話[J];中國稻米;2002年06期

3 ;我國科學家“解讀”水稻基因[J];發(fā)明與革新;2002年06期

4 ;我國率先破譯水稻基因 解決全球一半人吃飯問題[J];國土經(jīng)濟;2002年05期

5 ;水稻基因竟然比人的基因還多[J];科技廣場;2002年05期

6 平;用中國水稻養(yǎng)活全世界[J];南方農(nóng)村;2002年04期

7 道吉;首屆國際水稻大會在京召開[J];南京農(nóng)專學報;2002年03期

8 ;我國科學家“鳥槍”搞定水稻基因[J];農(nóng)家之友;2002年05期

9 ;水稻基因“精細圖”讓中國農(nóng)業(yè)吃了“定心丸”[J];江西農(nóng)業(yè)科技;2003年01期

10 ;我國啟動破解雜交水稻基因功能密碼工程[J];食品科學;2005年08期

相關會議論文 前10條

1 趙基洪;;水稻與菰屬間性狀轉(zhuǎn)移研究[A];新世紀 新機遇 新挑戰(zhàn)——知識創(chuàng)新和高新技術產(chǎn)業(yè)發(fā)展（下冊）[C];2001年

2 張國良;陳文軍;戴其根;許軻;霍中洋;張洪程;;水稻耐1，2，4-三氯苯脅迫基因型的篩選[A];中國作物學會栽培專業(yè)委員會換屆暨學術研討會論文集[C];2007年

3 裴忠有;;水稻T—DNA插入群體的建立及突變體篩選[A];2008中國作物學會學術年會論文摘要集[C];2008年

4 張桂權;丁效華;曾瑞珍;張澤民;李文濤;陳兆貴;劉冠明;何風華;AkshayTulukdar;劉芳;席章營;黃朝鋒;朱文銀;易懋升;秦利軍;施軍瓊;趙芳明;馮明姬;單澤林;陳嵐;郭曉琴;JaiChandRana;;水稻功能基因組學材料平臺的建立[A];中國的遺傳學研究——中國遺傳學會第七次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編[C];2003年

5 王景余;孫海波;李艷萍;鄒美智;;水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究及應用進展[A];中國農(nóng)業(yè)生物技術學會第三屆會員代表大會暨學術交流會論文摘要集[C];2006年

6 姬生棟;秦廣雍;耿颯;盛有名;薛華政;吳劉成;徐存拴;霍裕平;;離子束介導玉米基因組DNA的水稻后代遺傳性狀研究[A];全國作物生物技術與誘變技術學術研討會論文摘要集[C];2005年

7 李陽生;朱英國;;水稻設計育種[A];中國的遺傳學研究——中國遺傳學會第七次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編[C];2003年

8 羅彥長;王守海;;分子標記輔助水稻抗病蟲育種進展[A];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)理論與實踐——安徽現(xiàn)代農(nóng)業(yè)博士科技論壇論文集[C];2007年

9 沈輝;王宗陽;;水稻OsEBP89基因啟動子的功能分析[A];中國植物生理學會全國學術年會暨成立40周年慶祝大會學術論文摘要匯編[C];2003年

10 陳石燕;王宗陽;;T-DNA介導的promoter trap系統(tǒng)[A];中國植物生理學會第九次全國會議論文摘要匯編[C];2004年

相關重要報紙文章 前10條

1 ;日本破譯3.2萬個水稻基因[N];今日信息報;2003年

2 田耕;水稻基因組圖譜帶來希望與困惑[N];大眾科技報;2002年

3 本報記者 徐玲玲;楊煥明：評說水稻“基因大戰(zhàn)”[N];科技日報;2001年

4 本報駐美國記者 王如君;水稻基因研究里程碑（科技大觀）[N];人民日報;2002年

5 楊健、蔣建科;水稻基因“天書”被打開[N];人民日報;2005年

6 通訊員 婁沂春 記者 馬瑛瑛;浙大成功開發(fā)大容量水稻基因芯片[N];浙江日報;2001年

7 記者　韓曉玲、通訊員　王景剛;水稻基因研究獲突破性進展 將全面提升我國水稻國際競爭力[N];湖北日報;2006年

8 鄧肯;永久保護世界水稻資源協(xié)議簽訂[N];科技日報;2007年

9 徐瑞哲;滬蘇皖育出“軟糯”水稻新品種[N];農(nóng)民日報;2006年

10 劉新萍;高個水稻具有玉米特性[N];江蘇科技報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 王兆海;水稻類病變相關基因SPL29的克隆和功能研究[D];武漢大學;2014年

2 楊慧;水稻精氨酸酶基因啟動子表達模式及精氨酸酶基因的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

3 李萬昌;2個水稻苗期失綠葉基因的圖位克隆[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2013年

4 陳雋;水稻穗型與粒型調(diào)控基因FUWA的圖位克隆與功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

5 黃立鈺;水稻抗旱比較轉(zhuǎn)錄組學分析及候選基因OsDRAP1功能驗證[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

6 劉小云;水稻H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶基因的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

7 崔迪;粳稻抗逆性關聯(lián)分析及云南農(nóng)家保護水稻地方品種遺傳多樣性的歷時變化[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

8 崔彥茹;利用選擇育種群體進行水稻高產(chǎn)、抗旱和耐鹽QTL定位[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

9 陳偉;水稻代謝組的生化及遺傳基礎研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

10 周航;組配改良劑對土壤—水稻中重金屬遷移累積的影響[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2014年

相關碩士學位論文 前10條

1 崔永濤;水稻半顯性矮稈基因(Semi-dominant Dwarf1)Si-dd1的精細定位[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

2 張遠森;基于通路分析法詮釋水稻農(nóng)藝性狀全基因組關聯(lián)研究[D];昆明理工大學;2015年

3 沈孝輝;施硅對水稻砷吸收的影響[D];南京信息工程大學;2015年

4 章潘;水稻過氧化物酶體型醛縮酶OsAld-Y的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

5 蘇鋒;砷和草甘膦復合污染對水稻生長的影響及其機理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

6 王娜;水稻苗期耐鹽性鑒定及相關QTL分析[D];寧夏大學;2015年

7 王嬌;水稻抗旱性相關性狀的QTL定位分析[D];寧夏大學;2015年

8 朱曉龍;湘中某工礦區(qū)土壤、水稻鎘砷污染特征與遷移規(guī)律[D];中南林業(yè)科技大學;2015年

9 高曉慶;水稻稻瘟病抗性相關基因的篩選和功能鑒定[D];浙江師范大學;2015年

10 陳鵬程;水稻OsCBL5在植物耐鹽信號傳導中的作用研究[D];浙江師范大學;2015年

，

本文編號：1735847