本文選題：ZIP11 + 肉雞��； 參考：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：鋅是機(jī)體必需的微量元素,機(jī)體需要準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)鋅穩(wěn)態(tài)平衡,讓鋅水平維持在正常的范圍內(nèi)。機(jī)體的鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控主要是由鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZNT與ZIP家族負(fù)責(zé)。ZIP11則是ZIP家族全新的基因,之前尚未見關(guān)于ZIP11功能的研究報(bào)道。由沙門氏菌污染禽肉引起的人食源性疾病仍然是世界衛(wèi)生組織面臨的主要問題之一。肉雞大腸桿菌感染或內(nèi)毒素刺激均會(huì)出現(xiàn)典型的“低鋅血癥”,血清鋅降低,肝臟鋅升高；同時(shí)多項(xiàng)研究暗示病原微生物感染可能會(huì)影響機(jī)體先天免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞)的鋅穩(wěn)態(tài)。但沙門氏菌感染對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響與調(diào)控機(jī)理目前仍不清楚。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其中的作用也是未知,ZIP11是否參與其中有待研究。本研究將全面系統(tǒng)地回答這些問題,共開展以下三項(xiàng)研究：實(shí)驗(yàn)一：ZIP11在機(jī)體鋅代謝中的作用與機(jī)理研究本研究以野生型小鼠與細(xì)胞系為模型,全面系統(tǒng)地研究ZIP11在機(jī)體鋅代謝中的作用與機(jī)理。首先通過生物信息學(xué)分析ZIP家族在真核上的分布規(guī)律與進(jìn)化關(guān)系,從不同的真核生物類群(如哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、植物與原生動(dòng)物等)中挑選了25種具有代表性的真核生物的ZIP基因進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZIP11是ZIP家族gufA亞家族的唯一成員,起源于真核生物早期的祖先。在分析Zip11在小鼠不同組織中的表達(dá)規(guī)律,發(fā)現(xiàn)mZip11在消化系統(tǒng)中高表達(dá)(胃、回腸與盲腸)。而在HEK293T細(xì)胞上轉(zhuǎn)染mZIP11質(zhì)粒與在RAW26.7細(xì)胞上沉默Zip11后,測定細(xì)胞內(nèi)鋅含量與MT的基因表達(dá),證實(shí)ZIP11是一個(gè)鋅的轉(zhuǎn)入蛋白。給野生型小鼠補(bǔ)鋅后,發(fā)現(xiàn)Zipll無論是mRNA還是蛋白水平均顯著升高。隨后的熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)Zip11第一個(gè)外顯子上游區(qū)域存在多個(gè)MRE序列,可響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鋅的變化。突變分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多MRE可調(diào)控Zip11啟動(dòng)子的活性,MTF-1參與到Zip11表達(dá)調(diào)控的過程中�？傊�,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZIP11具有特殊的序列與結(jié)構(gòu)特征,負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)鋅的轉(zhuǎn)運(yùn),鋅通過MTF-1綁定到Zip11啟動(dòng)子區(qū)域的MRE序列上調(diào)控Zipll的基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二：沙門氏菌感染對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機(jī)理研究實(shí)驗(yàn)選用48只1dAA肉公雞,飼養(yǎng)7d后按體重?zé)o差異原則隨機(jī)分為兩組：組為對照組,另外一組為沙門氏菌攻毒組。分別在攻毒后第1、3與7d收集血清、肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊、十二指腸、空腸、回腸與盲腸等組織,用于鋅含量與鋅代謝相關(guān)基因的分析。同時(shí),分離正常與被感染雞只的血液中性粒細(xì)胞,檢測鈣衛(wèi)蛋白與鋅代謝相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明,7 d肉雞沙門氏菌感染后血清鋅顯著降低(P0.05),肝臟鋅明顯升高(P0.05),機(jī)體出現(xiàn)了典型的“低鋅血癥”。與對照組相比感染組十二指腸中鋅含量極顯著降低(P0.01),但法氏囊與盲腸中的鋅含量顯著升高(P0.05)。機(jī)體通過限制十二指腸對鋅的吸收,同時(shí)將鋅重分布到肝臟、法氏囊與盲腸等組織,從整體上調(diào)控鋅的穩(wěn)態(tài)平衡,來限制沙門氏菌對鋅的吸收與利用。除此之外,沙門氏菌感染后極顯著地增加中性粒細(xì)胞MT與S100A9的表達(dá)(P0.01)。機(jī)體通過改變中性粒細(xì)胞的鋅穩(wěn)態(tài),從而介導(dǎo)鈣衛(wèi)蛋白的表達(dá)與分泌,分泌到腸腔中的鈣衛(wèi)蛋白會(huì)螯合掉食糜中的鋅,進(jìn)一步限制沙門氏菌對鋅的吸收與利用。沙門氏菌感染對肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)的影響主要是通過顯著改變宿主鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的(P0.05)。宿主通過上調(diào)鋅的轉(zhuǎn)入蛋白ZIP14,下調(diào)鋅的轉(zhuǎn)出蛋白ZNT1、ZNT、ZNT5、ZNT6、 ZNT8與ZNT9的表達(dá)將鋅重分布到肝臟；此外下調(diào)ZIP5、ZIP10、ZIP11、ZIP12、 ZIP13與ZIP14在十二指腸中的表達(dá),限制鋅的吸收。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體會(huì)上調(diào)中性粒細(xì)胞中的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP3、ZIP8、ZIP10與ZIP14的表達(dá),增加中性粒細(xì)胞中的鋅含量,從而極顯著增加鈣衛(wèi)蛋白的表達(dá)(P0.01)�？傊�,沙門氏菌感染顯著影響肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)。機(jī)體通過調(diào)控鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)在整體水平與細(xì)胞水平上分別介導(dǎo)鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控,來共同抵抗沙門氏菌的感染。多個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在這個(gè)過程中發(fā)揮重要的作用,ZIP11也參與到其中。實(shí)驗(yàn)三：巨噬細(xì)胞游離鋅調(diào)控在抗沙門氏菌感染中的作用與機(jī)理研究本研究以RAW264.7巨噬細(xì)胞為模型,在沙門氏菌感染的同時(shí),通過添加鋅或鋅螯合劑改變巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鋅的水平,利用熒光顯微、流式細(xì)胞儀、RT-PCR與免疫印跡等技術(shù)檢考察游離鋅改變對沙門氏菌感染與增殖的影響；同時(shí)考察游離鋅改變對宿主NF-κB信號通路以及ROS與RNS產(chǎn)生的影響。除此之外,還在MT1敲除的RAW264.7巨噬細(xì)胞上驗(yàn)證之前的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞感染沙門氏菌后游離鋅會(huì)聚集在巨噬細(xì)胞內(nèi),并影響沙門氏菌的感染。螯合巨噬細(xì)胞內(nèi)的游離鋅通過增加巨噬細(xì)胞ROS與RNS的產(chǎn)生,增加巨噬細(xì)胞對沙門氏菌的殺傷,從而減少沙門氏菌的感染。相反,額外增加巨噬細(xì)胞的水平通過影響NF-κB p65的激活,減少ROS與RNS的產(chǎn)生,結(jié)果沙門氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長得更好。在敲掉細(xì)胞內(nèi)重要的游離鋅綁定蛋白MT1后,沙門氏菌在MT1敲除的巨噬細(xì)胞內(nèi)生長的更好。這是由于伴隨巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鋅含量升高的同時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS與RNS的產(chǎn)生也減少。深入研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌陽性的細(xì)胞相比沙門氏菌陰性的細(xì)胞含有更多的自由鋅,而ROS與RNS的產(chǎn)生被抑制。這暗示感染后巨噬細(xì)胞游離鋅的聚集可能是沙門氏菌逃避NF-κB介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞殺傷,長久地在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存的新策略。綜上所述,ZIP11是一個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在機(jī)體鋅代謝過程中發(fā)揮重要作用。此外,ZIP11的mRNA與蛋白水平均受鋅調(diào)控,鋅調(diào)控ZIP11的表達(dá)主要通過MTF-1綁定到ZIP11扁動(dòng)子區(qū)域的MRE序列上來實(shí)現(xiàn)。肉雞沙門氏菌感染后,機(jī)體通過調(diào)控十二指腸鋅的吸收,同時(shí)將鋅重分布到肝臟、法氏囊與粒細(xì)胞等組織或細(xì)胞,從整體與細(xì)胞水平上調(diào)控機(jī)體的鋅穩(wěn)態(tài),共同抵抗沙門氏菌的感染,ZIP11也參與到其中。在肉雞體內(nèi)沙門氏菌感染后,機(jī)體出現(xiàn)血清鋅降低,可能會(huì)減少體內(nèi)巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鋅的含量,有利于宿主對沙門氏菌的清除。但值得注意的是,體外巨噬細(xì)胞沙門氏菌感染模型中的結(jié)果提示,沙門氏菌可通過改變巨噬細(xì)胞的鋅穩(wěn)態(tài),抑制巨噬細(xì)胞對其殺傷,長期在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活。
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【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

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1 伍愛民;鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Zip11的功能及沙門氏菌攻擊對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機(jī)理研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號：1732295