本文關(guān)鍵詞：禽呼腸孤病毒Sigma-C蛋白引起宿主細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

禽呼腸孤病毒Sigma-C蛋白引起宿主細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理研究

張志強(qiáng)  

【摘要】：禽呼腸孤病毒(avian reovirus,ARV)感染引起家禽的病毒性關(guān)節(jié)炎、慢性呼吸道癥狀、生長遲緩和吸收不良綜合征等疾病,給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。ARV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是造成病毒感染所引起組織損傷的重要誘因,在ARV病毒蛋白中,sigma-C (σC)蛋白被證實能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)理尚不明確。 本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,確認(rèn)過表達(dá)ARV σC蛋白能夠在DF-1、BHK-21和Hela三種細(xì)胞上誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探尋ARV σC蛋白引起細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理,以aC蛋白作為“誘餌”蛋白,利用酵母雙雜交技術(shù)從雞脾臟cDNA文庫中尋找與aC蛋白發(fā)生相互作用的宿主細(xì)胞靶蛋白,并通過β-半乳糖營酶實驗加以確認(rèn)。 為給后續(xù)研究提供必要實驗工具,以原核表達(dá)的aC重組蛋白免疫小鼠,最終得到兩株細(xì)胞株可以穩(wěn)定分泌針對aC蛋白高特異性、高親和力單克隆抗體。Western Blot和間接免疫熒光實驗結(jié)果表明,所得兩株單抗能夠特異性識別ARV感染細(xì)胞中病毒σC蛋白,為深入研究σC的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 基于酵母雙雜交篩選的實驗結(jié)果,進(jìn)一步證實了候選靶蛋白真核延伸因子1儀亞基1(EEF1A1, eukaryotic elongation factor1alpha1)與細(xì)胞凋亡進(jìn)程相關(guān),利用免疫共沉淀和激光共聚焦兩種實驗方法證實,ARV σC蛋白與EEF1A1蛋白在宿主細(xì)胞中相互作用,并且通過pull down實驗分析確定二者相互作用的區(qū)域位于aC蛋白C末端210-246位氨基酸殘基區(qū)域內(nèi)。 進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)沉默DF-1細(xì)胞中內(nèi)源性EEF1A1表達(dá),并以此為基礎(chǔ)研究EEF1A1與σC相互作用對σC和ARV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。實驗數(shù)據(jù)表明,EEF1A1表達(dá)沉默后,過表達(dá)aC蛋白所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被顯著抑制,而ARV所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被部分抑制。深入研究發(fā)現(xiàn),沉默EEF1A1表達(dá)能夠抑制σC蛋白和ARV病毒誘導(dǎo)的Caspase-9和Caspase-3活化以及細(xì)胞色素C釋放,實驗結(jié)果證實EEF1A1在σC和ARV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。此外,對病毒滴度進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn),沉默EEF1A1表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡有利于ARV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。 本研究揭示了σc蛋白引起宿主細(xì)胞凋亡機(jī)理,證明aC蛋白與宿主細(xì)胞EEF1A1蛋白相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步揭示ARV感染致病機(jī)理、研制新型疫苗以及疫病防控提供參考。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

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