本文選題：亞洲玉米螟　切入點(diǎn)：黑化反應(yīng)　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：昆蟲缺乏脊椎動(dòng)物所具有的獲得性免疫系統(tǒng),主要依賴發(fā)達(dá)的天然免疫系統(tǒng)來抵御病原物的入侵。昆蟲天然免疫反應(yīng)由體液免疫和細(xì)胞免疫組成,其中體液免疫反應(yīng)主要包括抗菌肽的產(chǎn)生和黑化反應(yīng)。酚氧化酶是黑化反應(yīng)的關(guān)鍵酶,其激活依賴于級聯(lián)反應(yīng)的絲氨酸蛋白酶途徑。絲氨酸蛋白酶(serineprotease,SP),尤其是具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的絲氨酸蛋白酶(clip domain serine protease),在黑化反應(yīng)中發(fā)揮著重要功能。它們是一類以絲氨酸殘基為活性中心的蛋白水解酶,由兩部分組成——位于N端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(clip domain)和位于C端的催化區(qū)域(catalytic domain),其中催化區(qū)域中存在一個(gè)由組氨酸,絲氨酸和天門冬氨酸組成的催化三角。絲氨酸蛋白酶在體內(nèi)以酶原的形式存在,當(dāng)病原物入侵信號被識別后,一系列絲氨酸蛋白酶被級聯(lián)激活,最終導(dǎo)致酚氧化酶原激活酶(prophenoloxidase-activating protease,PAP)被激活,進(jìn)而切割激活酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)產(chǎn)生有活性的酚氧化酶(phenoloxidase,PO)導(dǎo)致黑色素的形成。黑化反應(yīng)被絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,serpin)所調(diào)控,以防黑化反應(yīng)的過度進(jìn)行對昆蟲本身產(chǎn)生傷害。絲氨酸蛋白酶抑制劑通過識別特異的絲氨酸蛋白酶并與之結(jié)合形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物,從而抑制絲氨酸蛋白酶的活性,起到調(diào)控黑化反應(yīng)的作用。亞洲玉米螟是重要的農(nóng)業(yè)害蟲,為探究其天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制,本文首先檢測了病原微生物入侵亞洲玉米螟幼蟲后的免疫活性,確定了亞洲玉米螟被外源物誘導(dǎo)后確實(shí)能產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)。隨后我們選取了 3個(gè)絲氨酸蛋白酶(OfSP1、OfSP13、OfSP105)和3個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin-3、serpin-6、serpin-11)為研究對象,利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)等手段,研究了它們之間的相互關(guān)系,及在黑化反應(yīng)中的功能和作用機(jī)制,得到了以下研究結(jié)果:1.球孢白僵菌的入侵,可明顯誘導(dǎo)亞洲玉米螟幼蟲的黑化反應(yīng),并顯著提高幼蟲淋巴液的酚氧化酶活性。2.病原微生物侵染亞洲玉米螟幼蟲可顯著提高淋巴液的抗菌活性,其中3種抗菌肽基因(OfgLys6、OfgAtt和OfgIID)屬于誘導(dǎo)型表達(dá)基因。3.我們成功克隆了 3種絲氨酸蛋白酶基因(SP1、SP13、SP105)的全長序列,并對其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。它們的時(shí)空和誘導(dǎo)表達(dá)模式互不相同。4.我們利用Bac-to-Bac真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了 SP1、SP13、SP105重組蛋白,并利用生化手段獲得了純化的重組蛋白,其中SP1、SP13、SP105的激活位點(diǎn)被突變成了可被商業(yè)化蛋白酶FactorXa識別切割的IEGR,獲得了可在體外被激活的SP1、SP13、SP105蛋白。5.利用獲得的重組蛋白進(jìn)行一系列研究表明:在亞洲玉米螟黑化反應(yīng)的發(fā)生過程中,SP1是SP13的上游蛋白酶,能直接切割激活SP13酶原。激活的SP13可進(jìn)一步切割激活酚氧化酶原,因此SP13是一個(gè)酚氧化酶原激活酶。與此同時(shí),SP1不能激活SP105酶原,但是FactorXa體外激活的SP105也可以直接切割激活酚氧化酶原,也是一個(gè)酚氧化酶原激活酶。6.絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3和seprin-6均可與SP13和SP105形成穩(wěn)定復(fù)合物,并抑制它們激活酚氧化酶原。Seprin-6還可與SP1結(jié)合形成復(fù)合物,但serpin-11與SP1、SP13、SP105均不能形成復(fù)合物。所以,serpin-3和serpin-6可調(diào)控亞洲玉米螟的黑化反應(yīng),但serpin-11無此功能。本論文的創(chuàng)新之處在于:我們首次克隆了 3個(gè)亞洲玉米螟絲氨酸蛋白酶基因——SP1、SP13和SP105,并且明確了它們在黑化反應(yīng)中的作用機(jī)制,還解析它們被3個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3、serpin-6、serpin-11調(diào)控的分子機(jī)制。我們首次在亞洲玉米螟中得到2個(gè)酚氧化酶原激活酶,這為進(jìn)一步解析亞洲玉米螟乃至其他昆蟲的天然免疫分子機(jī)制提供了基礎(chǔ),也為將來利用亞洲玉米螟的天然免疫系統(tǒng)進(jìn)行生物防治提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S435.132

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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2 劉守柱;薛超彬;羅萬春;;黃粉蟲幼蟲體壁硬化過程中酚氧化酶活性的變化[J];昆蟲學(xué)報(bào);2009年09期

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4 馮從經(jīng),杜予州,陸自強(qiáng),符文俊;亞洲玉米螟幼蟲血清中酚氧化酶原的性質(zhì)[J];昆蟲學(xué)報(bào);2005年05期

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本文編號：1700573