本文選題：CTRP6　切入點(diǎn)：豬　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：脂肪的沉積包含脂肪細(xì)胞增殖、分化和聚酯成熟,該過程受到多種轉(zhuǎn)錄因子和脂肪分泌因子的級聯(lián)調(diào)控。而且脂肪組織在體內(nèi)的沉積和分布是影響胴體品質(zhì)和肉質(zhì)風(fēng)味的關(guān)鍵因素。因此,研究脂肪分泌因子在脂肪細(xì)胞增殖分化過程中的作用機(jī)理,對家畜的肉質(zhì)改良有著重要的意義。CTRP6是一種脂肪分泌因子,屬于補(bǔ)體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白家族,其蛋白結(jié)構(gòu)與脂聯(lián)素極其相似。研究表明,在ob/ob小鼠和脂聯(lián)素敲除鼠的脂肪組織和血清中,CTRP6的含量顯著上升,然而PPARγ的激動劑-羅格列酮卻能顯著抑制CTRP6在脂肪組織中的表達(dá)。此外,CTRP6還可增強(qiáng)骨骼肌細(xì)胞AMPK/ACC的磷酸化,促進(jìn)脂肪酸的氧化。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),在3T3-L1脂肪細(xì)胞分化過程中CTRP6的表達(dá)豐度發(fā)生顯著變化。根據(jù)以上研究結(jié)果,推測CTRP6可能在豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮重要作用。為了驗(yàn)證CTRP6的細(xì)胞學(xué)功能,利用流式細(xì)胞術(shù)、Elisa、熒光素酶報(bào)告分析、油紅O染色、real-time qPCR和Western blot等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù),檢測了CTRP6在豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞增殖分化過程中的表達(dá)規(guī)律,以及CTRP6對細(xì)胞的增殖、分化和相關(guān)信號通路的影響。并且采用CoIP技術(shù)、Erk1/2和p38信號通路特異性抑制劑處理的方法,明確了CTRP6在肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞增殖分化過程中的作用機(jī)制。為了完善試驗(yàn)結(jié)果,我們又從活體水平探討了CTRP6對白色和棕色脂肪組織的作用。獲得結(jié)果如下:1.在豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞增殖分化過程中,CTRP6表達(dá)量隨著細(xì)胞的增殖而降低,并且主要存在于脂肪細(xì)胞的胞質(zhì)中。肌內(nèi)脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,CTRP6 mRNA的表達(dá)量逐漸升高,在分化第4d達(dá)到最高峰,然后進(jìn)入“平臺期”。在皮下脂肪細(xì)胞分化過程中CTRP6的表達(dá)量持續(xù)上升。2.構(gòu)建豬CTRP6基因慢病毒表達(dá)載體,獲得CTRP6-shRNA慢病毒,滴度為6.2×107pfu/ml,其能夠顯著抑制脂肪細(xì)胞中CTRP6的表達(dá)量。在此基礎(chǔ)上,研究表明干擾CTRP6對脂肪細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用,主要體現(xiàn)在增加了細(xì)胞周期蛋白基因CyclinB和CyclinE的表達(dá)。在脂肪細(xì)胞分化過程中,干擾CTRP6能夠顯著減少細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累(P0.01),抑制脂肪細(xì)胞的分化,降低成脂關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白水平,同時(shí)提高脂解基因ATGL mRNA的表達(dá)量(P0.05)。3.在肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞中,外源加入CTRP6重組蛋白可有效的抑制細(xì)胞的增殖,顯著促進(jìn)細(xì)胞的分化和脂質(zhì)積累(P0.01),提高脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志因子PPARγ和aP2mRNA及蛋白的表達(dá)量。4.MicroRNA-29a通過靶基因CTRP6調(diào)節(jié)豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞的增殖分化。在轉(zhuǎn)染miR-29a agomir之后,添加外源CTRP6重組蛋白,能夠減緩miR-29a對脂肪細(xì)胞的作用。5.CTRP6通過Erk1/2和p38MAPK信號通路調(diào)控肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞的分化,以及皮下脂肪細(xì)胞的增殖。在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖過程中,CTRP6則主要作用于p38MAPK信號通路。此外在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中,CTRP6能夠與AdipoR1形成復(fù)合物。6.對小鼠腹腔注射pLentiH1-CTRP6-shRNAm慢病毒,可實(shí)現(xiàn)對小鼠組織和血清中CTRP6干擾作用。與對照組相比,干擾CTRP6的表達(dá)可顯著降低小鼠體重及白色脂肪組織的重量(P0.01),但不影響其攝食量。同時(shí),干擾CTRP6能顯著下調(diào)脂肪組織中脂肪細(xì)胞的大小(P0.01),這主要是由于脂肪組織發(fā)生棕色化而造成的。并且CTRP6表達(dá)量的降低,可提高小鼠胰島素敏感性和葡萄糖耐受性,調(diào)節(jié)血清中Adiponectin、Leptin和TG含量。綜上所述,在豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞中CTRP6是miR-29a的靶基因,miR-29a可調(diào)節(jié)CTRP6的表達(dá)量;CTRP6通過MAPK信號通路調(diào)控脂肪細(xì)胞的增殖與分化;并且在豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中,AdipoR1是CTRP6的受體,CTRP6通過AdipoR1作用于下游信號通路。此外,活體試驗(yàn)表明干擾CTRP6可提高胰島素敏感性,增強(qiáng)葡萄糖耐受性,促進(jìn)白脂棕色化以及棕色脂肪的形成。
[Abstract]:The role of CTRP6 in the process of proliferation and differentiation of adipose cells was studied by flow cytometry ( FCM ) , ELISA , luciferase reporter assay , oil red O staining , real - time qPCR and Western blot . In addition , CTRP6 can regulate the proliferation and differentiation of adipose cells in mouse tissues and serum . In addition , CTRP6 can regulate the proliferation and differentiation of adipose cells in mouse tissues and serum . In addition , CTRP6 can improve insulin sensitivity and glucose tolerance in mice . In addition , in vivo tests , the interference CTRP6 can improve insulin sensitivity , enhance glucose tolerance , promote white fat browning and brown fat .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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本文編號：1689097