本文選題：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型　切入點：豬肺泡巨噬細(xì)胞　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是一個小的共價閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒。該病毒是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic syndrome, PMWS)的主要病原,另外它與多種豬病密切相關(guān),如繁殖障礙、肉芽腫性腸炎、豬皮炎腎病綜合征等,給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。本研究首先通過TMT標(biāo)記的定量磷酸化蛋白組技術(shù),對PCV2作用豬肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary alveolar macrophages, PAMs) 6 h后的差異磷酸化蛋白進行分析,共發(fā)現(xiàn)了 213個差異表達(dá)磷酸化蛋白;其中線粒體抗病毒信號(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS )磷酸化蛋白顯著上調(diào),提示PCV2引發(fā)先天免疫激活;進一步研究發(fā)現(xiàn)髓樣分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene88, MyD88),干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors, IRFs ),DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors, DAI)和視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白 1(retinoic acid induced gene-1,RIG-1 )在PCV2感染誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生中起著重要的作用;另外,研究表明RIG-1和DAI能夠影響PCV2的復(fù)制,這些研究為闡明PCV2的免疫特性和感染機制奠定了理論基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:1. TMT定量分析PCV2感染仔豬肺泡巨噬細(xì)胞差異磷酸化蛋白的表達(dá)豬巨噬細(xì)胞是PCV2在體內(nèi)的靶細(xì)胞之一。為了深入研究PCV2作用原代培養(yǎng)PAMs磷酸化位點的變化情況,運用質(zhì)譜分析定量的等量異位標(biāo)簽技術(shù)(Tandem Mass Tag, TMT ),對PCV2作用PAMs 6 h后的差異磷酸化蛋白進行分析,共發(fā)現(xiàn)了 213個差異表達(dá)磷酸化蛋白,其中87個磷酸化蛋白顯著上調(diào)(含102個磷酸化位點),126個磷酸化蛋白顯著下調(diào)(含178個磷酸化位點)。這些蛋白涉及生物結(jié)合、細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞黏附等。了解這些差異表達(dá)磷酸化蛋白,為進一步研究PCV2的致病機理提供了線索。2. NF-κB在PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌Ⅰ型干擾素信號途徑中的作用核轉(zhuǎn)錄因子κB( nuclear factor kappa B, NF-κB )通過與干擾素調(diào)節(jié)因子3 (interferon regulatory factor 3, IRF3 )和干擾素調(diào)節(jié)因子7 (interferon regulatory factor 7, IRF7)相互協(xié)作參與Ⅰ型干擾素分泌,在機體先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。為了研究NF-κB在PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌Ⅰ型干擾素信號途徑中的作用,將無菌分離的PAMs,隨機分為四組:對照組、PCV2組、NF-κB-抑制劑組(抑制劑組)和NF-κB抑制劑-PCV2組(抑制劑-PCV2組)進行體外培養(yǎng)。間接免疫熒光法(indirect immunoinfluscent assay,IFA)定位檢測結(jié)果表明,PCV2可感染PAMs,并主要存在于細(xì)胞漿中;Western Blot方法檢測結(jié)果表明,較強的NF-κB抑制劑BAY 11-7082抑制了抑制性κB (inhibitor of NF-κB, IκB)的磷酸化,進而抑制IκBα降解和隨后的NF-κB核轉(zhuǎn)運。ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中α干擾素(interferon α, IFN-α)和β干擾素(interferon β, IFN-β )的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)PCV2能誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-α;而抑制NF-κB活化后,PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-α的作用并未下降,表明NF-κB信號途徑可能不參與PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-Ⅰ的過程。3. PCV2通過MyD88-IRFs信號途徑誘導(dǎo)PAMs Ⅰ型干擾素的表達(dá)為了進一步闡明PCV2引起PAMs分泌IFN-Ⅰ的信號途徑,采用siRNA方法將MyD88基因沉默,探討MyD88-IRFs信號途徑在PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-Ⅰ中的作用。結(jié)果表明,PCV2上調(diào)IFN-α基因轉(zhuǎn)錄與IKKα、IRF7和IRF3有極大的關(guān)系。干擾PAMs中MyD88基因后,減弱了 PCV2對IKKα、IRF3、IRF7和IFN-α的轉(zhuǎn)錄上調(diào)作用。另外,相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IFN-α與IRF3,IRF7,MyD8 之間呈顯著的正相關(guān)性,而IFN-β與IRF3、IRF7之間也呈顯著的正相關(guān)性。這些結(jié)果都表明PCV2可以通過MyD88-IRF(s)信號途徑影響Ⅰ型干擾素的表達(dá)。4. PCV2通過RIG-1和DAI影響PK15細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素作用的初步研究RIG-1和DAI是Ⅰ型干擾素產(chǎn)生途徑的上游信號分子。為了研究RIG-1和DAI是否影響PCV2誘發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生,針對豬RIG-1和DAI基因的保守區(qū)分別設(shè)計4對siRNA序列,同時設(shè)計1對陰性對照siRNA序列,構(gòu)建重組慢病毒。將獲得的濃縮重組慢病毒侵染PK15細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選,獲得具有抗性的陽性細(xì)胞,單克隆篩選后,通過熒光定量PCR和Western Blotting的方法驗證干擾效率,成功獲得了細(xì)胞內(nèi)RIG-1和DAI基因和蛋白呈穩(wěn)定低水平表達(dá)的PK15-shRIG-1和PK15-shDAI細(xì)胞系。用PCV2感染PK15-shRIG-1和PK15-shDAI細(xì)胞系后Ⅰ型干擾素產(chǎn)生水平顯著下降;而且PK15-shRIG-1和PK15-shDAI細(xì)胞系中PCV2的復(fù)制能力顯著降低。表明RIG-1和DAI信號可能參與了 PCV2誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生過程,并與PCV2在PK15細(xì)胞中的復(fù)制有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1667902