本文選題：氧化應激　切入點：柔嫩艾美耳球蟲　出處：《山西農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：艾美耳球蟲是對全球養(yǎng)雞業(yè)危害嚴重的寄生蟲疾病,往往造成嚴重的經(jīng)濟損失。在已知的雞艾美耳球蟲中,E.tenella是對機體損傷最為嚴重的一種,主要寄生于雞的盲腸上皮細胞內(nèi),破壞盲腸上皮細胞,造成盲腸出血,形成血便,最終導致雞的死亡。在E.tenella對機體造成嚴重損失的過程中,盲腸上皮細胞的凋亡是其損傷的一種主要方式。線粒體途徑是E.tenella感染宿主細胞凋亡的通路之一。氧化應激是E.tenella感染機體所造成的一種結果,氧化應激與線粒體途徑介導的細胞凋亡之間的關系如何,在E.tenella所誘導的線粒體凋亡途徑中發(fā)揮怎樣的作用及其機制如何,這正是本試驗想要解決的問題。本試驗采用雞盲腸上皮細胞原代培養(yǎng)技術、流式細胞術、實時熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫法、分光光度法,從分子和細胞水平研究氧化應激在E.tenella感染宿主細胞線粒體凋亡通路中的作用與機理,并通過ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸、NOS抑制劑L-NMMA,NOX抑制劑夾竹桃麻素、XO抑制劑非布索坦、mitoKATP通道開放劑二氮嗪對感染E.tenella的雞盲腸上皮細胞進行預處理,檢測細胞培養(yǎng)液中H202和NO水平,細胞中NOS及caspase 9活性、細胞中磷酸化JNK和磷酸化p38水平,MPTP開放程度,線粒體及細胞質中cyt c含量、細胞中BCL-2和BAX基因的mRNA及蛋白表達水平,從而探明ROS與NO在E.tenella感染的雞盲腸上皮細胞凋亡過程的作用機制。試驗結果表明：(1) E.tenella感染+夾竹桃麻素處理組(T1組)、E.tenella感染+非布索坦處理組(T2組)的E.tenella感染率與E.tenella感染組(T組)在E.tenella子孢子感染后各時間點差異不顯著(P0.05),這表明抑制細胞內(nèi)ROS生成酶的活性與E.tenella的感染率之間沒有顯著的相關性。E.tenella感染+L-NMMA處理組(T3組)的E.tenella感染率在感染后96 h、120h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)高于T組,表明抑制NO的生成有利于E.tenella在細胞內(nèi)的發(fā)育。E.tenella感染+N-乙酰半胱氨酸處理組(T4組)的E.tenella感染率在E.tenella子孢子感染后24 h、96 h、120 h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組,表明清除細胞內(nèi)的ROS可以降低E.tenella在細胞內(nèi)的感染率。E.tenella感染+二氮嗪處理組(T5組)的E.tenella感染率在感染后96h、120h極顯著地(P0.01)高干T組.這表明開放mitoKATP通道可以抑制宿主細胞凋亡,延長E.tenella在細胞內(nèi)的發(fā)育時間,有利于E.tenella的發(fā)育,提高宿主細胞的感染率。(2)T組細胞內(nèi)ROS和NO水平分別在感染后24h-120 h和24 h-96 h極顯著地(P0.01)高于C組,表明感染E.tenella會導致宿主細胞氧化應激反應。(3)T1組細胞內(nèi)NOX活性和ROS水平分別在感染后4h-120h和24 h-120 h極顯著地(P0.01)低于T組；T2組細胞內(nèi)XO活性和ROS水平在感染后24 h-120 h極顯著地(P0.01)低于T組：T3組細胞內(nèi)NOS活性和NO水平分別在感染后4 h、24 h、72 h、120h和4h-120h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組,這表明感染E.tenella的盲腸上皮細胞的ROS和NO增多可由NOX、XO和NOS激活而引起。(4)感染雞胚盲腸上皮細胞后24 h-120 h,T組細胞培養(yǎng)液中H202含量和NO水平極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)高于C組,表明細胞產(chǎn)生的ROS和NO可以釋放于細胞外。(5) E.tenella子孢子感染雞胚盲腸上皮細胞后24 h-120 h和24 h、72 h、96 h、120 h,T3組和T4組細胞早期凋亡率分別在感染后顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組。表明抑制NO的生成、清除ROS可以有效地減少因感染E.tenella而引起的細胞早期凋亡。(6)T3組和T4組細胞MPTP開放程度分別在感染后48 h和24 h極顯著地(P0.01)低于T組,表明氧化應激可以部分促進E.tenella感染宿主細胞MPTP的開放。(7)T3組和T4組的細胞caspase9活性分別在感染后24h-120h和48h-120h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組；T3組和T4組細胞線粒體內(nèi)cyt c水平分別在感染后24 h、48 h、96 h、120 h和48 h、96 h、120 h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)高于T組；T3和T4組胞漿cytc水平在感染后24 h-120 h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組,表明E.tenella感染引發(fā)的氧化應激可通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。(8)T3組和T4組胞細內(nèi)磷酸化JNK和磷酸化p38水平分別在感染后4 h-120 h和4 h、24 h、48 h、72 h、120 h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組：T3和T4組細胞BCL-2蛋白表達分別在感染后4h、48 h、72h、120h和4h-72h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)高于T組；T3組和T4組細胞內(nèi)BAX蛋白表達在感染后24h-96h極顯著地(P0.01)低于T組;T3和T4組細胞BCL-2 mRNA表達水平分別在感染后24 h-120 h和24h、72 h、96 h、120 h極顯著地(P0.01)高于T組：T3和T4組細胞BAXmRNA表達水平分別在感染后4h、48h、72h、96 h、120 h和24 h-120 h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組,表明氧化應激通過激活JNK和p38,并調控BCL-2和BAX的表達量進而影響細胞凋亡。(9)T5組的早期凋亡率與晚期凋亡和壞死率水平分別在感染后24 h、72 h、96h、120 h和48 h-120 h顯著(P0.05)或極顯著地(P0.01)低于T組,T5組的DNA損傷率、caspase 9和caspase 3活性在感染后24h-120h極顯著低于T組(P0.01),表明開放mitoKATP通道可以通過抑制caspase 9和caspase 3活性降低因感染E.tenella而引起的細胞凋亡。(10)T5組的細胞內(nèi)ROS和NO水平分別在感染后24 h、48 h、72 h、120 h和4 h、48 h、72 h極顯著地(P0.01)低于T組;T5組的細胞培養(yǎng)液中的H202含量和NO水平分別在感染后4h-120h和48 h、72 h極顯著地(P0.01)低于T組,表明開放mitoKATP通道可以降低因感染E.tenella而引起的ROS和NO水平的升高。
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【學位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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本文編號：1666463