發(fā)布時間：2018-03-26 04:02

  本文選題：尖孢鐮刀菌CS-20　切入點：黃瓜枯萎病　出處：《廣西大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：由致病性尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的枯萎病為毀滅性土傳病害,常造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。目前枯萎病的防治缺乏有效方法,如抗病品種和化學(xué)防治藥劑,因此研究生物技術(shù)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性成為防治作物枯萎病害的重要技術(shù)途徑。非致病性尖孢鐮刀菌株CS-20(Fusarium oxysporum CS-20)是從美國佛羅里達州的抑制西瓜枯萎病的土壤中分離而來,對作物枯萎病具有較好的防治效果,但是菌株CS-20誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生的防御反應(yīng)機制尚不明確,且菌株CS-20中哪些生防因子起作用以及它們誘導(dǎo)抗病的具體分子機理也未清楚,從而限制了菌株CS-20開發(fā)應(yīng)用。因此,本研究以黃瓜感病品種9930和菌株CS-20為研究對象,一方面解析菌株CS-20誘導(dǎo)黃瓜植株產(chǎn)生防御反應(yīng)機制；另一方面從菌株CS-20次生代謝物合成基因聚酮合成酶(polyketide biosynthase, PKS)禾口非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS) 中挖掘誘導(dǎo)抗病的關(guān)鍵效應(yīng)基因并闡明其具體功能。主要取得以下結(jié)果：1.明確感病黃瓜品種9930在根部接種菌株CS-20后,黃瓜苗產(chǎn)生的抗病反應(yīng)機制。提前接種CS-20可誘導(dǎo)黃瓜苗產(chǎn)生抗病性,顯著降低黃瓜苗的病情指數(shù)；熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GFP (green fluorescent protein)標(biāo)記菌株CS-20只侵入和定殖在黃瓜苗主根和側(cè)根部表面,與黃瓜植株保持一個穩(wěn)定的互生關(guān)系；接種菌株CS-20可激活黃瓜苗根部組織的水楊酸信號途徑、茉莉酸信號途徑和茉莉酸／乙烯信號途徑,且特異性地誘導(dǎo)鈣離子通道基因的上調(diào)表達。2.基于菌株CS-20的全基因組測序結(jié)果,生物信息學(xué)分析預(yù)測到10個PKS基因,14個NRPS基因,3個PKS-NRPS雜合基因,3個DAMT(prenyltransferase)基因。qRT-PCR (quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction)分析結(jié)果表明：菌株CS-20和致病菌FOC-BN分別接種黃瓜苗根部72h后,侵入根部的兩菌株中PKS-NRPS基因表達差異顯著。比較發(fā)現(xiàn)：在菌株CS-20中有9個基因特異表達,其中4個基因(FOWE_10925、FOWE_10935、FOWE_11643、FOWE_19588)特異上調(diào),5個基因特異下調(diào)(FOWE_00999、FOWE_12767、FOWE_03871、FOWE_16548 和 FOWE_11163),推測它們可能與其誘導(dǎo)黃瓜苗植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性相關(guān)；在致病菌FOC-BN巾15個基因特異上調(diào)表達,推測它們可能與其致病性相關(guān)。3.采用Split marker gene deletion method方法對菌株CS-20的9個可能與誘導(dǎo)抗病性相關(guān)基因進行敲除,結(jié)合PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化方法和潮霉素抗性篩選,并通過PCR 和 Southern bolt驗證,獲得了9個與誘導(dǎo)抗病性相關(guān)基因缺失突變體("縁OWE_00999(T87)、"縁OWE_12767 (T28)、"縁OWE_03871 (T19)、"縁OWE_06548 (T5)、"縁OWE_10925 (T17、"縁OWE_11163 (T16)、"縁OWE_10935 (T13)、"縁OWE_01643 (T9)和"縁OWE_09588 (T20))。野生型菌株CS-20與突變體"縁OWE_11163(T16)培養(yǎng)形態(tài)無明顯差異,而與其它8個候選效應(yīng)基因缺失突變體存在明顯差異；9個候選效應(yīng)基因缺失突變體和野生型菌株菌落生長直徑每一天都存在明顯差異(p0.05),其中突變體"縁OWE_10925 (T17)和"縁OWE_11163 (T16)的生長速率與野生型相當(dāng),其它7個突變體的生長速率則均小于野生型菌株的生長速率。4.采用挑戰(zhàn)接種和split-root接種方法分析9個候選基因缺失突變體在誘導(dǎo)抗病水平上差異,其中6個突變體("縁OWE_00999、"縁OWE_12767、"縁OWE_03871、 "縁OWE_06548、"縁OWE_10925和"縁OWE_11163)接種后的病情指數(shù)顯著高于野生型菌株CS-20,推斷該6個候選效應(yīng)基因與誘導(dǎo)黃瓜苗產(chǎn)生抗病性密切相關(guān),為菌株CS-20誘導(dǎo)抗病的關(guān)鍵效應(yīng)基因。相對于野生型菌株,6個關(guān)鍵效應(yīng)基因突變體處理后黃瓜苗根部和葉部的NPR1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,與清水對照處理結(jié)果一致。在處理的黃瓜苗根部組織中,LOX1和PAL1基因表達水平均顯著低于野生型菌株,但PR3基因表達只在突變體"縁OWE＿12767處理顯著降低；相對于根部組織,處理后葉部組織中只有茉莉酸／乙烯信號途徑(PAL1)基因表達水平值差異較大,其它信號途徑基因的轉(zhuǎn)錄水平在6個效應(yīng)基因缺失突變體、野生型和清水處理之間整體上保持在一個水平曲線。5.功能結(jié)構(gòu)域分析表明：誘導(dǎo)抗病的6個關(guān)鍵效應(yīng)基因均包含ketosynthase (KS)、 acyl transferase (AT)、β-ketoreductase (KR)、dehydrogenase (DH) 和 enoyl reductase (ER),均屬于HR (highly reducing)-PKSs類型,合成產(chǎn)物為線性碳鏈或非芳香烴類化合物�；诟鞴δ芙Y(jié)構(gòu)域的蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明：6個關(guān)鍵效應(yīng)基因的各功能單元都各自處在一個小分支上,彼此之間親緣關(guān)系較遠。6.菌株CS-20的IKS-NRPS基因合成產(chǎn)物預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)6個關(guān)鍵效應(yīng)基因均未見合成產(chǎn)物報道。采用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測了6個關(guān)鍵效應(yīng)基因缺失突變體和野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的成分,進一步差異比對和代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析,推測關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE_00999可能合成產(chǎn)物為11,12,13-trihydroxy-9-octadecenoic acid,分子式為C18H34O5;關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE_12767可能合成產(chǎn)物為9,10,13-trihydroxy-11-octadecenoic acid (C18H34O5);關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE_03871可能合成產(chǎn)物為5-hydroxy-2-octadecenoic acid,分子式為C18H34O3;關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE_16548未找到線性類差異化合物；關(guān)鍵效應(yīng)基因I?OWE_10925可能合成產(chǎn)物為8-methoxy-13-hydroxy-9,11-octadecadienoic acid,分子式為C19H34O4;關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE_11163可能合成產(chǎn)物為10-hydroxy-undecanoic acid,分子式為C11H22O3。所推測的5個化合物為未知新化合物,是否作為誘導(dǎo)子具有誘導(dǎo)抗病作用需進一步驗證。本研究首先明確菌株CS-20根部接種后可誘導(dǎo)黃瓜苗本身產(chǎn)生防御反應(yīng)機制；其次,以菌株CS-20切入點,創(chuàng)新性地從次生代謝物合成基因方面研究誘導(dǎo)抗病的關(guān)鍵效應(yīng)的基因及其功能,并對關(guān)鍵效應(yīng)基因的產(chǎn)物進行了初步鑒定。因此,本研究系統(tǒng)地闡明非致病尖孢鐮刀菌CS-20誘導(dǎo)黃瓜抗枯萎病的分子機制,為生防菌防控枯萎病奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.421.13
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本文編號：1666241