本文選題：Rhizoctonia　切入點：solani　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：玉米是我國重要的糧食作物及工業(yè)原料。近年來玉米紋枯病已成為玉米生產(chǎn)上的主要病害。該病害優(yōu)勢致病菌為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn) AG-1-IA融合群。植物細胞均具有細胞壁,且植物的地上部分的表皮還覆蓋著角質(zhì)層。植物病原真菌和細菌都能產(chǎn)生一系列降解角質(zhì)層和細胞壁的酶,如角質(zhì)酶、纖維素酶和果膠酶等,這些酶類幫助植物病原真菌和細菌穿透植物細胞壁并在植物體內(nèi)蔓延。目前,植物病原真菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶在真菌與植物互作機制方面引起人們的廣泛興趣和關(guān)注。前人的研究發(fā)現(xiàn),在真菌與植物互作過程中,真菌木聚糖酶和果膠酶具有PAMP分子的特點,而纖維素酶一直未受到重視。我們的研究中,以一個R. solani (AG-1-IA) β-1,4-內(nèi)切纖維素酶EG1為研究對象,對其在與寄主植物互作過程中的作用與機制進行了研究與討論。EG1含有227個氨基酸,aa1-20為信號肽序列,屬于45家族糖苷水解酶。我們通過基因定點突變將氨基酸序列第32位的天冬氨酸(Aspartic acid, Asp)突變?yōu)楸彼?Alanine, Ala),導(dǎo)致其催化活性的喪失。將EG1的野生型(WT)與突變型(D32A)基因分別插入pPIC9K載體構(gòu)建酵母表達載體并轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115感受態(tài)細胞,然后進行誘導(dǎo)表達、純化和ddH2O透析,獲得純酶,對兩者進行了一系列驗證與分析,以轉(zhuǎn)化空pPIC9K載體的P. pastoris表達產(chǎn)物作為對照(CK)EG1的野生型WT和突變型D32A在40nM濃度水平可以引起玉米、煙草和擬南芥葉片組織的壞死,同時引起這些植物三個防衛(wèi)反應(yīng)標志基因表達水平的上調(diào),包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和病程相關(guān)蛋白(PR1α)。對被40nM的WT和D32A侵染3d后的玉米的奇甜蛋白、組胺受體、β-1,3-葡聚糖酶、病原相關(guān)蛋白10、交替氧化酶、鋅指同源蛋白、幾丁質(zhì)酶、病原相關(guān)蛋白4和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等十個防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的熒光實時定量PCR的檢測,我們發(fā)現(xiàn),這些基因的表達水平也都存在不同程度的上調(diào)。利用煙草懸浮細胞作為處理對象,40nM的WT和D32A可以誘導(dǎo)煙草懸浮細胞活性氧(ROS)的產(chǎn)生、鈣離子(Ca2+)的積累、培養(yǎng)介質(zhì)的堿化和乙烯的生物合成。這些現(xiàn)象與結(jié)果均符合PAMP分子的特點,證明EG1確實是一個PAMP分子,同時該PAMP活性與EG1的催化活性相互獨立。接著我們采用PVX表達系統(tǒng)實驗為我們提供有力的證據(jù)。首先通過PCR擴增的方法在EG1的野生型與突變型基因5’末端引入信號肽序列,然后插入pGR106空載構(gòu)建PVX表達載體,轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101感受態(tài)細胞。將攜帶重組質(zhì)粒的A. Tumefaciens菌液接種煙草葉片,5d可以使煙草葉片產(chǎn)生明顯的壞死。用EG1制備多克隆抗體,以抗植物肌動蛋白鼠單克隆抗體作為內(nèi)參照,對接種5d的葉片提取物進行蛋白質(zhì)印記分析,我們檢測到了EG1條帶。同時對接種5d的葉片提取物進行EG1催化活性的檢測,顯示野生型具有較高的催化活性,而突變型活性極低。這些結(jié)果從植物體內(nèi)的角度證實了EG1是一個PAMP分子。為了找到EG1發(fā)揮PAMP活性的結(jié)構(gòu)域,我們對EG1野生型及突變型的6個保守區(qū)域進行了突變。其中突變第六個保守區(qū)后,WT-M具有較高的催化活力,可以引起植物組織壞死而不能提高植物防衛(wèi)反應(yīng)標志基因的表達量；而D32A-M沒有催化活力,且既不能引起植物組織的壞死,也不能使植物防衛(wèi)反應(yīng)基因過量表達。我們猜測,第六個保守區(qū)可能是EG1 PAMP活性的關(guān)鍵區(qū)域。為了證實這個猜測,我們又檢測了WT-M和D32A-M對煙草懸浮細胞產(chǎn)生ROS的影響,發(fā)現(xiàn)兩者均不能誘導(dǎo)煙草懸浮細胞活性氧的產(chǎn)生和培養(yǎng)介質(zhì)的堿化；利用PVX表達系統(tǒng)實驗,發(fā)現(xiàn)WT-M可以使煙草葉片產(chǎn)生壞死,而D32A-M則不可以。這些結(jié)果證實了該保守區(qū)(aa172-180,序列為CNWRFDWFQ)即為EG1發(fā)揮PAMP活性的關(guān)鍵區(qū)域。目前,國內(nèi)外對于玉米紋枯病的研究主要集中于發(fā)病規(guī)律和防治措施,但是從分子水平上對R. solani與寄主的互作機制的研究較少。本研究證實了R. solaniβ-1,4-內(nèi)切纖維素酶EG1是一個PAMP分子,其PAMP活性與催化活性相互獨立,同時也確立了其發(fā)揮PAMP活性的關(guān)鍵區(qū)段。這些研究結(jié)果為進一步闡明R. solani與寄主的互作機制提供了理論依據(jù),為玉米紋枯病的有效防治奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S435.13

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本文編號：1601140