本文選題：自交不親和　切入點(diǎn)：S-位點(diǎn)受體激酶　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自交不親和性(self-incompatibility,SI)是植物為了限制自交衰敗和促進(jìn)雜交優(yōu)勢(shì),在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種復(fù)雜而完善的重要遺傳機(jī)制。蕓薹屬植物表現(xiàn)為孢子體自交不親和性(Sporophytic self-incompatibility,SSI),當(dāng)前國(guó)際前沿對(duì)于SSI的分子研究?jī)?nèi)容主要集中在SI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件協(xié)同作用以抑制自體花粉萌發(fā)或花粉管生長(zhǎng)的機(jī)制上。早期普遍認(rèn)為在自花花粉落到干性柱頭上后,花粉S-位點(diǎn)半胱氨酸富集蛋白(S-locus cysteine-rich protein,SCR)與柱頭S-位點(diǎn)受體激酶(S-locus receptor kinase,SRK)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合,從而導(dǎo)致SRK的構(gòu)象發(fā)生改變,使其釋放原本結(jié)合在SRK激酶結(jié)構(gòu)域的類硫氧還蛋白1/2(Thioredoxin-h-like protein 1/2,THL1/2),激發(fā)SRK激酶活性,而后激活的SRK與M-位點(diǎn)受體激酶(M-locus protein kinase,MLPK)發(fā)生某種瞬間的相互作用,將SI信號(hào)傳遞到柱頭乳突細(xì)胞的胞內(nèi)。接著SRK與臂重復(fù)蛋白1(Arm repeat containing 1,ARC1)結(jié)合引發(fā)ARC1的磷酸化作用與細(xì)胞質(zhì)定位,隨后ARC1泛素化Exo70A1,進(jìn)而致使柱頭乳突細(xì)胞中水分和一些小分子物質(zhì)不能正常分泌,最終實(shí)現(xiàn)SI反應(yīng)。然而介導(dǎo)SRK與ARC1互作的核心結(jié)構(gòu)域是怎么樣的,ARC1在自交不親和反應(yīng)中如何介導(dǎo)親和因子Exo70A1的泛素化降解還是未知的,甚至ARC1是否是SRK唯一下游底物還存在質(zhì)疑。雖然近年來人們?cè)诟仕{(lán)等蕓薹屬作物孢子體型自交不親和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理研究方面取得了顯著進(jìn)展,但是關(guān)于SRK下游信號(hào)傳導(dǎo)通路組成蛋白的分離與鑒定的研究要滯后得多。自從1998年ARC1被鑒定為SRK的下游靶蛋白后,直至2009年才發(fā)現(xiàn)Exo70A1作為自交親和因子與ARC1發(fā)生泛素作用被降解。然而轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反義抑制B.napus和A.lyrata中ARC1基因表達(dá),以及過量表達(dá)B.napus中Exo70A1基因,均只能部分打破材料的不親和性,由此說明ARC1-Exo70A1組成的信號(hào)通路可能只是SRK下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的其中一個(gè)分支。植物受體激酶下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑通常都是由多個(gè)信號(hào)元件和信號(hào)分支組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于自交不親和信號(hào)傳導(dǎo)過程,當(dāng)前國(guó)際上普遍認(rèn)為柱頭內(nèi)還存在其他未知信號(hào)元件和信號(hào)分支,它們可能與ARC1-Exo70A1分支一起共同參與下游信號(hào)傳導(dǎo),在蕓薹屬和擬南芥不同生態(tài)型中,不同的信號(hào)分支參與信號(hào)傳導(dǎo)的效應(yīng)不同,因此當(dāng)前研究工作的重點(diǎn)就是分離和鑒定這些未知的信號(hào)元件和信號(hào)分支并探討其功能。基于此,本研究以高度自交不親和甘藍(lán)“A4”為材料,擴(kuò)增SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全長(zhǎng)序列,通過酵母雙雜交技術(shù)篩選SRK-ARC1-Exo70A1的核心互作模體,基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選與SRK下游響應(yīng)自交不親和反應(yīng)的泛素靶蛋白,同時(shí)克隆得到SRK下游MLPK的新轉(zhuǎn)錄本MLPKn1,通過生物信息學(xué)分析、q RT-PCR、瞬時(shí)表達(dá)及轉(zhuǎn)基因等技術(shù)研究其功能。獲得主要研究結(jié)果如下:(1)SRK-ARC1-Exo70A1核心作用結(jié)構(gòu)域的確定利用分子克隆技術(shù)從高度自交不親和甘藍(lán)材料中擴(kuò)增得到SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全長(zhǎng)序列,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SRK激酶域包含DUF3660、Tyrkc和DUF3403結(jié)構(gòu)域,ARC1包含亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、U-box及4個(gè)ARM結(jié)構(gòu)域,Exo70A1包含亮氨酸拉鏈、高變區(qū)、反式SUMO化修飾模體及一個(gè)典型的Exo70結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建21個(gè)包含所有不同結(jié)構(gòu)域的截短體,將SRK及其截短體,Exo70A1及其截短體分別亞克隆到p GADT7載體中,ARC1及其截短體分別亞克隆到p GBKT7載體中,用PEG/Li Ac法將獲得的重組質(zhì)粒兩兩組合分別共轉(zhuǎn)化到酵母AH109感受態(tài)中,觀察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生長(zhǎng)情況和顏色變化情況,進(jìn)一步通過β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)相互作用強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SRK-ARC1互作組合中,SRK激酶域和ARC1含C端臂重復(fù)區(qū)截短體組合的β-半乳糖苷酶活性最大,說明它們是構(gòu)成二者互補(bǔ)界面的核心區(qū)段,縮短SRK激酶域中的任何結(jié)構(gòu)域,或減少ARC1任意一個(gè)臂重復(fù)區(qū),都會(huì)影響二者的相互作用。在ARC1-Exo70A1的互作組合中,ARC1含亮氨酸拉鏈和蜷曲螺旋的截短體與Exo70A1含高變區(qū)和反式SUMO化修飾模體的截短體組合的β-半乳糖苷酶活性最大,二者是構(gòu)成ARC1-Exo70A1互作界面的的核心區(qū)段;此外,比較SRK-ARC1-Exo70A1之間的β-半乳糖苷酶活性發(fā)現(xiàn)SRK-ARC1的作用強(qiáng)度小于ARC1-Exo70A1的作用強(qiáng)度。(2)基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出3個(gè)新的與S-位點(diǎn)受體激酶互作的泛素蛋白對(duì)比未授粉和授粉30 min甘藍(lán)柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出5個(gè)顯著差異表達(dá)的Bo PUB蛋白基因:Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB34、Bo PUB43和Bo PUB44。其中Bo PUB3和Bo PUB9在自花授粉處理30 min后顯著下調(diào)表達(dá),Bo PUB34,Bo PUB43和Bo PUB44在自花授粉處理30 min后顯著上調(diào)表達(dá)。對(duì)5個(gè)Bo PUB蛋白基因的克隆和序列分析發(fā)現(xiàn),5個(gè)Bo PUB蛋白均屬于植物泛素家族成員,其中Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43、Bo PUB44與ARC1一樣屬于PUB-ARM家族,Bo PUB34屬于Ser/Thr kinase家族。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)ARC1與Bo PUB9遺傳關(guān)系最近,Bo PUB3次之,與Bo PUB34遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。通過酵母雙雜交和GST-pull down檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SRK激酶域與Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43及ARC1的臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用,且相互作用強(qiáng)度為Bo PUB9Bo PUB3≈Bo PUB43ARC1。SRK與Bo PUB44和Bo PUB34均不能發(fā)生相互作用。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)Bo PUB3基因主要在柱頭中表達(dá),在自花授粉15 min,30 min和60 min處理后,表達(dá)量顯著降低,而Bo PUB9和Bo PUB43在所有組織中都表達(dá),我們推測(cè)Bo PUB3極有可能作為SRK下游靶蛋白參與自交不親和反應(yīng)。(3)甘藍(lán)MLPK同源基因MLPKn1的克隆及表達(dá)分析以甘藍(lán)“A4”材料gDNA和柱頭cDNA為模板,通過高保真DNA聚合酶擴(kuò)增得到MLPK的三個(gè)轉(zhuǎn)錄本Bo MLPKf1、Bo MLPKf2和Bo MLPKn1。Bo MLPKf1cDNA大小為1215bp,編碼404個(gè)氨基酸,Bo MLPKf2 cDNA大小為1233bp,編碼410個(gè)氨基酸。Bo MLPKn1為新獲得的轉(zhuǎn)錄本,其cDNA大小為1257bp,編碼418個(gè)氨基酸。Bo MLPKf1和Bo MLPKf2編碼的氨基酸之間只有N端不同,Bo MLPKf1和Bo MLPKn1N端均存在典型的豆蔻酰化模體,Bo MLPKf2 N端為疏水結(jié)構(gòu)域。和Bo MLPKf1/2相比,Bo MLPKn1有兩個(gè)插入序列,一個(gè)是在1,102-1,114bp之間有12 bp的插入,另一個(gè)是在1,152-1,182 bp之間有30 bp的插入。甘藍(lán)三個(gè)MLPK轉(zhuǎn)錄文本均具有一個(gè)高度保守的Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。利用半定量分析發(fā)現(xiàn)Bo MLPKf1和Bo MLPKn1基因在甘藍(lán)的葉片、花瓣、萼片、雄蕊和柱頭中均有表達(dá),Bo MLPKf2在柱頭中特異表達(dá)。q RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自花授粉后Bo MLPKf2相對(duì)表達(dá)量急劇升高,而15 min后開始急劇下降。Bo MLPKf1和Bo MLPKn1在自花授粉后表達(dá)量均略有升高,但變化不顯著。利用瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)Bo MLPKn1和Bo MLPKf1一樣定位在細(xì)胞膜上,通過Bi FC技術(shù)檢測(cè)Bo MLPKn1與SRK、ARC1均能在細(xì)胞膜上發(fā)生相互作用。通過線性分析發(fā)現(xiàn)蕓薹屬M(fèi)LPKn1基因是擬南芥At APK1b的直系同源基因,而不是以前報(bào)道的MLPKf1/2基因。MLPKf1/2基因是在蕓薹屬和擬南芥物種分化之后出現(xiàn)的,在蕓薹屬物種中通過與SRK互作引起自交不親和級(jí)聯(lián)反應(yīng),MLPKn1基因在整個(gè)十字花科進(jìn)化中是高度保守的,且不參與自交不親和反應(yīng)。(4)MLPKn1擬南芥同源基因At APK1b的功能研究MLPKn1基因是擬南芥AtAPK1b的直系同源基因,根據(jù)AtAPK1b的gDNA序列特征在第一個(gè)外顯子和第三個(gè)外顯子處設(shè)計(jì)兩個(gè)sg RNA位點(diǎn),并合成sg RNA引物,構(gòu)建p UC119-At U6-g RNA載體,進(jìn)而將重組載體連接到Cas9-p G626表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞,通過花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得T0代種子,用0.03%Basta篩選獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過T1代篩選和PCR測(cè)序檢測(cè)共獲得13個(gè)擬南芥At APK1b突變單株系。其中有堿基缺失長(zhǎng)度為21-509 bp的突變,也有額外堿基插入和堿基突變的現(xiàn)象。觀察T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥初步表型,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型相比,植株矮小,長(zhǎng)勢(shì)較弱,但能夠正常開花結(jié)子。(5)S-位點(diǎn)受體激酶相關(guān)因子在親和突變材料中編碼序列分析以高度自交親和“Yellow sarson”材料和不親和結(jié)球甘藍(lán)“A4”材料柱頭cDNA為模板,擴(kuò)增其SRK、MLPK、ARC1和Exo70A1基因編碼序列,并以花藥cDNA為模板擴(kuò)增SCR基因編碼序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個(gè)材料中S-位點(diǎn)受體激酶相關(guān)因子均具有完整的編碼序列,通過對(duì)SCR和SRK基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),甘藍(lán)“A4”材料與甘藍(lán)S28單倍型序列一致,“Yellow sarson”材料與白菜f2單倍型序列一致。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Bo SRKA4與Br SRKB的一致性為99%,與Br SRKQ之間的一致性為97%。Bo SCR與Br SCRB和Br SCRQ之間的一致性均為92%,有5個(gè)氨基酸的差異,Bo ARC1與Br ARC1Q和Br ARC1B的一致性均為93%,Bo Exo70A1與Br Exo70A1B和Br Exo70A1Q之間的序列一致性均為99%,只有一個(gè)氨基酸的差異。說明SCR、SRK、ARC1和Exo70A1基因在甘藍(lán)“A4”材料和“Yellow sarson”材料中具有較高的保守性。比較兩種材料MLPK氨基酸序列發(fā)現(xiàn),“Yellow sarson”材料的Br MLPKf1/2與甘藍(lán)的Bo MLPKf1/2相比,有6個(gè)氨基酸的差異,即Bo MLPKf1中K116-R,L183-I,G194-R,S288-N,T350-N,A365-E。根據(jù)前人的研究報(bào)道,MLPK的G194突變?yōu)镽后MLPK不具有自體磷酸化活性。因此,兩類材料自交親和性與SCR、SRK、MLPKn1、ARC1和Exo70A1基因序列差異沒有直接的關(guān)聯(lián),但是否是由MLPK基因的突變引起有待進(jìn)一步研究。(6)恢復(fù)MLPKf2基因的表達(dá)對(duì)“Yellow sarson”材料自交親和性的影響由于“Yellow sarson”材料中MLPK發(fā)生突變,MLPKf2在柱頭中特異表達(dá)。為了檢測(cè)恢復(fù)MLPKf2基因的表達(dá)對(duì)“Yellow sarson”材料自交親和性產(chǎn)生的影響,我們根據(jù)MLPKf2基因的全長(zhǎng)序列,結(jié)合植物雙元載體p CAMBIA1300多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物,構(gòu)建SLR柱頭特異性啟動(dòng)子的超表達(dá)載體p CAMBIA1300-MLPKf2,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化“Yellow sarson”下胚軸和子葉,經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、侵染、暗培養(yǎng)、愈傷分化、不定芽增值、生根、移栽等過程,獲得“Yellow sarson”轉(zhuǎn)基因植株。提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果均能檢測(cè)到正確的目的片段。通過q RT-PCR檢測(cè)MLPKf2在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平,結(jié)果均能檢測(cè)到MLPKf2基因的超量表達(dá),說明MLPKf2成功整合到轉(zhuǎn)基因植株中DNA。表型觀察發(fā)現(xiàn)野生型植株所結(jié)種莢正常生長(zhǎng)伸長(zhǎng),且多數(shù)種莢中可見明顯突起,而轉(zhuǎn)基因植株種莢短小、干癟,幾乎看不見突起的籽粒,并且種莢死亡情況嚴(yán)重。說明恢復(fù)MLPKf2的表達(dá)能部分恢復(fù)“Yellow sarson”材料的自交不親和性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S635

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1599507