本文選題：水稻　切入點(diǎn)：黃綠葉基因　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是世界上極其重要的糧食作物之一,同時(shí)也是單子葉植物研究的重要模式植物。水稻主要通過葉片中的葉綠體進(jìn)行光合作用,合成碳水化合物并將其貯藏于稻谷中。葉色突變是植物中普遍存在的一種現(xiàn)象,一般來說,葉色突變體都涉及到光合色素含量的變化,因而直接體現(xiàn)在葉片顏色的變化上。光合色素的主要功能就是吸收光能和傳遞電子,因此,其在光合生物的光合過程中扮演著關(guān)鍵角色。大量的研究結(jié)果顯示,葉色突變體是研究植物光合色素代謝、葉綠體結(jié)構(gòu)功能、葉綠體發(fā)育、光合作用以及光形態(tài)建成的理想材料。本研究利用了經(jīng)EMS(ethyl methane sulfonate)誘變秈稻恢復(fù)系縉恢10所產(chǎn)生的兩個(gè)黃綠葉突變體,克隆了兩個(gè)水稻黃綠葉基因YGL8和YGL9,并對(duì)其進(jìn)行了功能互補(bǔ)驗(yàn)證,同時(shí),對(duì)這兩個(gè)基因的器官特性表達(dá)情況以及相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,也對(duì)這兩個(gè)基因所編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能等進(jìn)行了分析,主要研究結(jié)果如下:1、水稻黃綠葉基因YGL9:(1)YGL9基因的克隆水稻ygl9突變體在整個(gè)生育期均表現(xiàn)為黃綠葉表型,但隨著植株的生長,葉片顏色少量加深。DNA和c DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),ygl9突變體的LOC_Os03g03990基因的第900個(gè)堿基由G突變?yōu)锳,使第300個(gè)氨基酸由色氨酸(TGG)突變?yōu)榻K止密碼子(TGA),導(dǎo)致翻譯的提前終止。LOC_Os03g03990編碼了可能的水稻葉綠體信號(hào)識(shí)別顆粒43 k Da蛋白(cp SRP43)。我們初步將其確定為YGL9的候選基因。(2)YGL9基因的功能互補(bǔ)驗(yàn)證為了確認(rèn)是否是LOC_Os03g03990的突變導(dǎo)致了ygl9突變體的黃綠葉表型,我們克隆了包含LOC_Os03g03990在內(nèi)的6812 bp野生型基因組序列(包括4373bp的編碼區(qū)上游序列、1167 bp的編碼區(qū)序列和1272 bp的編碼區(qū)下游序列)構(gòu)建功能互補(bǔ)載體并轉(zhuǎn)化ygl9突變體愈傷組織,陽性轉(zhuǎn)化植株的葉片全部恢復(fù)了正常綠色且其葉綠素和類胡蘿卜素含量也達(dá)到野生型水平。這些結(jié)果證明,LOC_Os03g03990基因就是YGL9基因。(3)YGL9蛋白結(jié)構(gòu)分析系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,YGL9屬于光合生物所特有的cp SRP43蛋白家族。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,YGL9位于葉綠體。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,YGL9與擬南芥的cp SRP43的序列高度相似,其成熟蛋白可能也包含了3個(gè)CD(CD1-3)結(jié)構(gòu)域和4個(gè)Ank(Ank1-4)結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)了蛋白與蛋白之間的相互作用。(4)YGL9基因的器官特異表達(dá)分析及相關(guān)基因的表達(dá)分析用實(shí)時(shí)定量PCR(realtime quantitative PCR,q RT-PCR)檢測(cè)了YGL9的器官特異表達(dá)情況,結(jié)果顯示,YGL9在綠色葉鞘和劍葉中的表達(dá)量較高,而在根、莖、白色幼穗和綠色幼穗中表達(dá)量較低。q RT-PCR結(jié)果顯示,在分蘗期,相比于野生型,ygl9突變體的部分葉綠素合成途徑相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平不同程度地下調(diào),所檢測(cè)的類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)酶基因也不同程度地下調(diào),部分捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein,LHCP)編碼基因也不同程度地下調(diào),此外,幾乎所有所檢測(cè)的葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因也不同程度地下調(diào);在抽穗期,相比于野生型,ygl9突變體的葉綠素和類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平均不同程度地上調(diào),LHCP基因的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到或超過野生型植株的表達(dá)水平,大部分葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平也達(dá)到或超過野生型植株的表達(dá)水平,但psa L和ndh A的轉(zhuǎn)錄水平仍大幅下調(diào)。(5)水稻cp SRP54的預(yù)測(cè)與分析通過STRING網(wǎng)站預(yù)測(cè)與YGL9互作的蛋白,得到兩個(gè)可能的水稻葉綠體信號(hào)識(shí)別顆粒54 k Da蛋白(cp SRP54)——LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556。測(cè)序結(jié)果顯示,LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556的編碼框全長分別為1653bp和1674 bp,均包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。序列比對(duì)結(jié)果顯示,LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556前體蛋白的氨基酸序列高度相似。q RT-PCR結(jié)果顯示,ygl9突變體中LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556的轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高,表明這兩個(gè)基因均直接或間接受到Y(jié)GL9突變的影響。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556均位于葉綠體。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,單子葉植物中存在兩類非常相似的LOC_Os11g05552類蛋白和LOC_Os11g05556類蛋白,他們與雙子葉植物和綠色藻類的cp SRP54蛋白聚在一起。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,LOC_Os11g05552、LOC_Os11g05556和擬南芥的cp SRP54的序列非常相似,而LOC_Os11g05552的C端具有與擬南芥的cp SRP54的C端一致的APPGTARRKR核心序列,其中的ARR序列是擬南芥的cp SRP54與cp SRP43結(jié)合的關(guān)鍵序列,但LOC_Os11g05556不包含這些關(guān)鍵序列。因此,我們認(rèn)為,LOC_Os11g05552類蛋白才是單子葉植物的cp SRP54蛋白。序列比對(duì)結(jié)果還顯示,LOC_Os11g05552的成熟蛋白也可能包含一段NG-domain和一段M-domain。(6)YGL9與LOC_Os11g05552的酵母雙雜交鑒定酵母雙雜交結(jié)果表明,YGL9與LHCP的L18結(jié)構(gòu)域互作,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,YGL9的Ank1-4結(jié)構(gòu)域與LHCP的L18結(jié)構(gòu)域互作,而YGL9的其他結(jié)構(gòu)域與LHCP的L18結(jié)構(gòu)域均不互作。而YGL9與LOC_Os11g05552的全長成熟蛋白不互作,可能是由于LOC_Os11g05552的NG-domain存在跨膜結(jié)構(gòu)域的緣故。為了排除可能的跨膜結(jié)構(gòu)域的影響,我們將LOC_Os11g05552的M-domain單獨(dú)與YGL9雜交,結(jié)果表明,LOC_Os11g05552的M-domain與YGL9互作,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,YGL9的CD2結(jié)構(gòu)域與LOC_Os11g05552的M-domain互作,而YGL9的其他結(jié)構(gòu)域與LOC_Os11g05552的M-domain均不互作。上述結(jié)果表明,YGL9即水稻的cp SRP43,LOC_Os11g05552即水稻的cp SRP54。2、水稻黃綠葉基因YGL8:(1)YGL8基因的克隆水稻ygl8突變體在整個(gè)生育期均表現(xiàn)為黃綠葉表型,但隨著植株的生長,葉片顏色少量加深。DNA和c DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),ygl8突變體的LOC_Os01g73450的第671個(gè)堿基由C突變?yōu)門,導(dǎo)致第224個(gè)氨基酸由丙氨酸(GCT)突變?yōu)槔i氨酸(GTT)。LOC_Os01g73450編碼了一個(gè)可能的UMP激酶。我們初步將其確定為YGL8的候選基因。(2)YGL8基因的功能互補(bǔ)驗(yàn)證為了確認(rèn)是否是LOC_Os01g73450的突變導(dǎo)致了ygl8突變體的黃綠葉表型,我們克隆了包含LOC_Os01g73450在內(nèi)的6478 bp野生型基因組序列(包括1570bp的編碼區(qū)上游序列、3844 bp的編碼區(qū)序列和1054 bp的編碼區(qū)下游序列)構(gòu)建功能互補(bǔ)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化ygl8突變體愈傷組織,陽性轉(zhuǎn)化植株的葉片恢復(fù)了正常綠色且其葉綠素總含量也達(dá)到野生型水平。對(duì)中花11的LOC_Os01g73450的RNA干涉結(jié)果顯示,陽性干涉植株均表現(xiàn)為黃綠葉表型,且其LOC_Os01g73450的轉(zhuǎn)錄水平大幅下調(diào)。這些結(jié)果證明,LOC_Os01g73450基因就是YGL8基因。(3)YGL8蛋白結(jié)構(gòu)分析亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,YGL8位于葉綠體。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,與YGL8同源的高等植物的UMP激酶與原核藍(lán)藻菌的UMP激酶聚在一起。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,與YGL8同源的高等植物的UMP激酶與原核生物細(xì)菌、藍(lán)藻的UMP激酶均包含非常相似的UMP激酶保守結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果表明,高等植物的葉綠體UMP激酶和細(xì)菌、藍(lán)藻的UMP激酶可能存在相似的結(jié)構(gòu)和功能。(4)YGL8基因器官特異表達(dá)分析及相關(guān)基因的表達(dá)分析用q RT-PCR檢測(cè)了YGL8的器官特異表達(dá)情況,結(jié)果顯示,YGL8在葉片中的表達(dá)量較高,而在根、莖、葉鞘、幼穗中的表達(dá)量較低。q RT-PCR結(jié)果顯示,在苗期時(shí),與野生型相比,ygl8突變體的部分葉綠素合成途徑相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅降低。此外,ygl8突變體的PSI的psa A、psa B和PSII的psb C的轉(zhuǎn)錄水平大幅下調(diào),而NADH脫氫酶的亞基編碼基因ndh B的轉(zhuǎn)錄水平大幅上調(diào)。這些基因的異常表達(dá)可能影響了ygl8突變體的葉綠體發(fā)育。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S511;Q943.2

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1 王忠偉;水稻黃綠葉基因YGL8和YGL9的克隆與功能分析[D];西南大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1586215