本文選題：昆蟲病原真菌　切入點(diǎn)：球孢白僵菌　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是廣泛用于農(nóng)林害蟲生物防治的昆蟲病原真菌,通常無(wú)性生殖,寄主范圍極廣,能適應(yīng)復(fù)雜多樣的寄主環(huán)境�；谇蜴甙捉┚恼婢鷼⑾x劑的有效成分是具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的侵染體,在田間常遭受夏季高溫、紫外輻射、化學(xué)農(nóng)藥等環(huán)境或人為脅迫因而影響田間防效和穩(wěn)定性。因此,研究揭示調(diào)控昆蟲病原真菌無(wú)性發(fā)育、抗逆力及致病力的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制,是利用真菌防治害蟲的科學(xué)基礎(chǔ),對(duì)菌株的遺傳改良、菌劑生產(chǎn)及合理應(yīng)用都具有十分重要的意義。本文首次嘗試通過(guò)構(gòu)建和分析蛋白組和修飾化蛋白組,以揭示蛋白磷酸化和乙�；瘜�(duì)球孢白僵菌生命活動(dòng)及生物防治潛能的意義,并通過(guò)絲裂素活化蛋白激酶Ste7磷酸化位點(diǎn)與甘露糖轉(zhuǎn)移酶Pmtl及Pmt4乙�；稽c(diǎn)的功能解析,驗(yàn)證磷酸化蛋白組和乙�；鞍捉M的可靠性。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果摘要如下：Cdc14作為球孢白僵菌細(xì)胞信號(hào)樞紐的蛋白/磷酸化蛋白組啟示 作為二元特異性磷酸酶,Cdc14通過(guò)去磷酸化酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸而調(diào)控真菌的細(xì)胞核行為,在球孢白僵菌已被證明能正向調(diào)控胞質(zhì)分裂、無(wú)性發(fā)育、多脅迫應(yīng)答及毒力。應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記和質(zhì)譜技術(shù),構(gòu)建和分析在正常條件下和氧化、高滲及胞壁干擾脅迫下由Cdc14介導(dǎo)的球孢白僵菌定量蛋白組和定量磷酸化蛋白組。結(jié)果顯示,cdc14缺失嚴(yán)重?cái)_亂細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)和磷酸化修飾的平衡。在正常條件下,cdc14缺失導(dǎo)致154個(gè)蛋白質(zhì)和86個(gè)磷酸化位點(diǎn)顯著上調(diào),117個(gè)蛋白質(zhì)和85個(gè)磷酸化位點(diǎn)顯著下調(diào)。在高滲鹽NaCl(1 M)、氧化劑H2O2 (3 mM)和胞壁干擾劑剛果紅(0.15 mg/mL)的脅迫下,相對(duì)于野生株,△cdcl4分別有23、41和79個(gè)蛋白質(zhì)顯著上調(diào),63、39和79個(gè)蛋白質(zhì)顯著下調(diào)；并分別有127、52和105個(gè)氨基酸殘基的磷酸化水平顯著上調(diào),112、47和226個(gè)氨基酸殘基的磷酸化水平顯著下調(diào)。差異組學(xué)的生物信息學(xué)分析顯示,Cdc14可通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和重要激酶／蛋白的磷酸化水平,而響應(yīng)不同的環(huán)境變化。這些蛋白和磷酸化修飾參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程,重點(diǎn)包括碳水化合物代謝、甘油磷脂代謝、MAPK激酶信號(hào)通路和DNA重塑等。這些結(jié)果表明,球孢白僵菌Cdc14能夠正向調(diào)節(jié)若干蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和磷酸化水平,涉及生長(zhǎng)發(fā)育及多脅迫應(yīng)答的信號(hào)通路,因而在球孢白僵菌的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起樞紐作用。球孢白僵菌信號(hào)傳導(dǎo)激酶Ste7及其磷酸化位點(diǎn)的功能解析球孢白僵菌Ste7是連接Fus3/Kss1信號(hào)通路的居中激酶,除了存在一對(duì)模式酵母中常見的保守磷酸化位點(diǎn)(S216和T220)之外,上述Cdc14介導(dǎo)的磷酸化修飾組還揭示其存在另外4個(gè)磷酸化位點(diǎn)(S362、S391、S440及T485)。通過(guò)構(gòu)建和分析ste7的缺失株和回補(bǔ)株以及雙位點(diǎn)突變株MS216A/T220A與單位點(diǎn)突變株MS362A、MS440A及MT485A,發(fā)現(xiàn)Δste7、MS362A及MfS216A/T220A諸多表型缺陷是一致的,包括在不同碳氮源上嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷和孢子萌發(fā)擔(dān)缺陷、產(chǎn)孢缺陷、多脅迫應(yīng)答缺陷以完全喪失經(jīng)體壁侵染昆蟲的毒力。這些表型在其余單點(diǎn)突變株中也發(fā)生不同程度的缺陷,而回補(bǔ)株的表型都恢復(fù)到野生株的水平。通過(guò)分析各菌株若干表型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)現(xiàn),中心發(fā)育通路中三個(gè)關(guān)鍵激活子(brlA、abaA及wetA)、上下游六個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(flbA～D、luG及vosA)以及營(yíng)養(yǎng)利用調(diào)控因子CreA的轉(zhuǎn)錄水平,在敲除株及所有點(diǎn)突變株中大多都較野生株顯著或劇烈下調(diào),相當(dāng)吻合其孢子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及侵染力方面的缺陷。五個(gè)P型N+/K+ATP激酶(enal-5)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在敲除株和所有點(diǎn)突變株中都劇烈下調(diào),十分吻合它們對(duì)NaCl和KCl脅迫的高度敏感性。此外,對(duì)主要抗氧化酶系的轉(zhuǎn)錄分析顯示,胞質(zhì)MnSOD (sod2)和兩個(gè)過(guò)氧化氫酶(catA和catP)的表達(dá)量大幅下調(diào)是Δste7、MS362A及MS216A/T220A等突變株抗氧化、耐高溫及抗紫外輻射能力減弱的重要原因。結(jié)果表明,Ste7及其6個(gè)Ser/Thr磷酸化位點(diǎn)對(duì)球孢白僵菌碳氮源利用、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、無(wú)性循環(huán)、多脅迫應(yīng)答及寄主侵染具有十分重要的意義,其中S216/T220與S362位點(diǎn)的磷酸化修飾對(duì)Ste7調(diào)控球孢白僵菌生命活動(dòng)的作用至關(guān)重要。因此,Cdc14介導(dǎo)的磷酸化修飾組所揭示的磷酸化蛋白及其修飾位點(diǎn),對(duì)深入研究球孢白僵菌的生命規(guī)律和生物防治潛能具有重要參考價(jià)值和啟示意義。球孢白僵菌賴氨酸乙�；鞍捉M的構(gòu)建與分析 賴氨酸乙酰化修飾普遍存在于原核和真核生物中,但真菌中目前僅見模式酵母的研究報(bào)道�；诳官嚢彼嵋阴；贵w對(duì)肽段的富集和LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析,首次成功構(gòu)建了球孢白僵菌的乙�；鞍捉M,從中鑒定出283個(gè)乙�；鞍椎�464個(gè)賴氨酸乙�；稽c(diǎn)。這些蛋白的乙酰化修飾主要參與基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑、蛋白質(zhì)折疊和糖／脂類代謝等生物學(xué)過(guò)程。生物信息學(xué)分析顯示,球孢白僵菌有6個(gè)乙�；ｓw,其中5個(gè)(KacY、KacH、 KacF、FxKac、KacxxxxK及KacW)也見于其它物種,因而是十分保守的,但其特有的模體KacW和17個(gè)乙�；鞍自诮湍钢胁淮嬖�。從鑒定出的乙�；鞍字羞x擇兩個(gè)O-甘露糖轉(zhuǎn)移酶Pmt1和Pmt4的乙�；稽c(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變和表型分析。結(jié)果顯示,Pmt1的定點(diǎn)突變K88R或K482R對(duì)分生孢子形成、氧化脅迫應(yīng)答、胞壁干擾脅迫答應(yīng)和致病力的影響等同或勝過(guò)Pmtl的功能缺失,而Pmt4的定點(diǎn)突變K360R具有一定的保生長(zhǎng)、穩(wěn)產(chǎn)孢、抗氧化、抗胞壁干擾及促致病的作用。因此,K88和K482兩個(gè)Pmt1位點(diǎn)的乙酰化修飾是Pmt1維持球孢白僵菌正常產(chǎn)孢、氧化及胞壁脅迫應(yīng)答和正常侵染力所必需的。Pmt4的K360乙�；揎検欠�(wěn)定球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫耐受力及侵染力所需要的。這些結(jié)果說(shuō)明蛋白乙�；揎椩谇蜴甙捉┚顒�(dòng)中的重要作用,由此驗(yàn)證了球孢白僵菌乙酰化修飾蛋白組的有效性和可利用性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S476.12

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本文編號(hào)：1585952