本文選題：山羊乳汁　切入點(diǎn)：?-乳球蛋白　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：山羊乳汁及其乳產(chǎn)品如酸奶、奶酪和奶粉等在很大程度上滿足了人類的營養(yǎng)需求。在醫(yī)療方面,對牛奶有過敏反應(yīng)及胃腸道消化功能紊亂的人更適于飲用羊奶。然而,雖然山羊乳汁能為人類提供豐富的營養(yǎng),但同時也可引發(fā)很多人尤其是嬰幼兒的過敏反應(yīng)。山羊乳汁中的一種主要的乳蛋白過敏原是?-乳球蛋白(?-lactoglobulin,BLG),它是山羊乳清蛋白的主要成分,占乳清總蛋白的53.7%左右。然而人的乳汁中不存在BLG,山羊乳汁BLG如同牛乳汁BLG一樣被認(rèn)為是引起嬰幼兒乳過敏癥的主要過敏原。人?-乳白蛋白(human?-lactalbumin,hLA)是人乳汁中一種主要的乳清蛋白質(zhì),占人乳總蛋白的28%左右,含有豐富的色氨酸及半胱氨酸。hLA能夠促進(jìn)乳汁產(chǎn)量相關(guān)因子即乳糖的合成,通過增加乳糖成分來提高乳汁產(chǎn)量。因hLA含有豐富的與大腦發(fā)育相關(guān)的氨基酸成分而具有促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育,調(diào)節(jié)食欲,睡眠等功能。研究表明,hLA還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及有效治療由人乳頭瘤病毒引起的皮膚疣等。近年來,由轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn),它能將傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)介導(dǎo)的基因打靶效率提高數(shù)個個數(shù)量級。本研究構(gòu)建了靶向山羊BLG基因第一外顯子的打靶載體,借助TALENs這種基因編輯工具,利用同源重組手段將人?-乳白蛋白基因定點(diǎn)插入到山羊BLG基因位點(diǎn),以期在達(dá)到敲除山羊BLG基因的同時利用BLG基因的內(nèi)源性啟動子啟動hLA基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而為生產(chǎn)低敏性山羊乳或人源化山羊乳奠定基礎(chǔ)。本研究內(nèi)容主要分為以下幾個部分:1.針對TALENs在山羊BLG基因第一外顯子的切割位點(diǎn),制備了靶向山羊BLG基因位點(diǎn)的基因打靶載體ploxpII-hLA-neo。此打靶載體以ploxpII為骨架載體,含有兩個同源臂大小分別為738 bp和714 bp左右的5’arm和3‘a(chǎn)rm,兩同源臂間為hLA和新霉素抗性基因序列(nemycine resistant gene,neo),同時neo兩端含有兩個同向的Loxp序列。2.為驗證hLA基因能否在內(nèi)源性BLG基因啟動子的調(diào)控下啟動表達(dá)并分泌到細(xì)胞外,本研究將構(gòu)建的含hLA的打靶載體ploxpII-hLA-puro和TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞。首先通過藥物篩選得到細(xì)胞克隆,然后用RT-PCR,Western blot等方法檢測抗藥性細(xì)胞克隆及上清。結(jié)果發(fā)現(xiàn),山羊乳腺上皮細(xì)胞中BLG mRNA水平降低,hLA mRNA有高水平表達(dá),且在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到hLA蛋白的存在。3.將構(gòu)建的打靶載體ploxpII-hLA-neo和TALEN質(zhì)粒DNA或mRNA共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維和成體成纖維細(xì)胞。通過G418藥物篩選初步獲得抗藥性細(xì)胞克隆,經(jīng)junction PCR和Long-range PCR鑒定發(fā)現(xiàn),TALENs DNA介導(dǎo)的同源重組共獲得83株陽性基因打靶細(xì)胞克隆,其中BLG單等位基因和雙等位基因突變細(xì)胞克隆效率分別為10.1%和1.1%;TALENs mRNA介導(dǎo)的同源重組共獲得86株基因打靶細(xì)胞克隆,其中BLG基因突變細(xì)胞克隆效率為8.4%,低于TALEN質(zhì)粒DNA介導(dǎo)的外源基因整合效率。4.將BLG單等位基因和雙等位基因突變細(xì)胞克隆作為核供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植。將每株克隆的早期卵裂重構(gòu)胚進(jìn)行體外培養(yǎng)并做PCR檢測,排除了混有非基因打靶細(xì)胞的細(xì)胞克隆。最后選取5株細(xì)胞活力較好且核型正常的基因打靶細(xì)胞克隆作為供體細(xì)胞生產(chǎn)體細(xì)胞克隆動物。將早期卵裂的重組胚胎共717枚(2-4細(xì)胞)移植到50只同期發(fā)情的受體山羊輸卵管中,60 d的妊娠率約為34%。妊娠足月共獲得6只體細(xì)胞克隆奶山羊,經(jīng)PCR和Southern blot鑒定發(fā)現(xiàn),其中1只為BLG雙等位基因修飾奶山羊,其余5只為BLG單等位基因修飾奶山羊。5.為分析基因打靶奶山羊乳汁成分及hLA的表達(dá),將5只青年期BLG單等位基因修飾奶山羊與野生型公山羊配種。妊娠結(jié)束后,采集轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁,分離乳汁中乳清蛋白成分。經(jīng)蛋白質(zhì)電泳及考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn),基因打靶奶山羊乳汁中BLG含量減少,?-lactalbumin成分升高;經(jīng)Western blot分析發(fā)現(xiàn),hLA在基因打靶奶山羊乳汁中獲得高表達(dá);經(jīng)ELISA分析,hLA在基因打靶奶山羊乳汁中的含量最高達(dá)1.2 mg/mL。通過對山羊乳汁中蛋白質(zhì),乳糖,脂肪和乳固形物分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁成分與野生型山羊乳汁成分之間沒有顯著性差異。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827

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本文編號：1574409