本文選題：彎曲菌　切入點(diǎn)：養(yǎng)殖環(huán)節(jié)　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：彎曲菌(Campylobacter)是一種細(xì)長(zhǎng)呈彎曲螺旋狀的革蘭陰性微需氧菌,一般具有極端鞭毛,是家禽和多種哺乳動(dòng)物的腸道共生菌。彎曲菌中能引起人類感染的主要是空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,簡(jiǎn)稱 C.jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli,簡(jiǎn)稱 C.coli)。人感染彎曲菌后主要癥狀為腹瀉、腹痛、發(fā)熱和嘔吐等,嚴(yán)重的可引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和格林巴利綜合癥等后遺癥,甚至在一些情況下可導(dǎo)致死亡。近年來世界范圍內(nèi)彎曲菌病病例發(fā)生率的指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)引起世界衛(wèi)生組織(WHO)和各國(guó)政府的高度關(guān)注。家禽是彎曲菌的天然宿主,被感染雞腸道內(nèi)彎曲菌定殖量可達(dá)106～109cfu/g,并且持續(xù)到屠宰前,造成屠宰過程中胴體及零售環(huán)節(jié)禽肉產(chǎn)品的交叉污染,給食品安全和公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)重隱患。研究表明消費(fèi)、處理污染的禽肉或直接接觸彎曲菌感染的家禽是人類彎曲菌病的最主要來源。控制或減少家禽彎曲菌感染是預(yù)防和控制人彎曲菌病的重要前提。盡管研究者們已作出了很多努力,但到目前為止世界范圍內(nèi)仍沒有一個(gè)切實(shí)有效的方法來防控雞群中彎曲菌的感染。因此繼續(xù)了解家禽養(yǎng)殖過程中彎曲菌的流行傳播特點(diǎn),分析雞群中彎曲菌的可能來源并有針對(duì)性地制定有效的防控措施顯得尤為重要。本研究選擇規(guī)�；u場(chǎng)的部分雞群,從種蛋孵化到飼養(yǎng)一定階段內(nèi)對(duì)雞群及周圍環(huán)境中彎曲菌的定性定量流行特點(diǎn)進(jìn)行研究,應(yīng)用建模軟件對(duì)部分雞群養(yǎng)殖過程中不同時(shí)間點(diǎn)彎曲菌實(shí)際帶菌量進(jìn)行擬合,獲得彎曲菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程;對(duì)不同來源及不同飼養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的分離菌株進(jìn)行分子亞分型分析,以了解其在家禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的傳播規(guī)律,探究雞群中彎曲菌的可能來源;制備空腸彎曲菌亞單位候選疫苗并對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià),為雞養(yǎng)殖過程中彎曲菌的防控提供研究基礎(chǔ)。1雞養(yǎng)殖過程彎曲菌流行特點(diǎn)分析2013年5月至2014年6月先后選擇飼養(yǎng)管理模式不同的A、B、C 3個(gè)規(guī)�；u場(chǎng)。雞場(chǎng)A為籠養(yǎng)模式,每間雞舍無固定飼養(yǎng)員,飼養(yǎng)場(chǎng)區(qū)無嚴(yán)格的生物安全消毒措施;雞場(chǎng)B和C為平養(yǎng)模式,每間雞舍均為固定飼養(yǎng)員,具有良好的生物安全消毒措施。對(duì)選自3個(gè)雞場(chǎng)的17個(gè)雞群分別采集孵化階段的種蛋表面擦拭樣品、飼養(yǎng)階段每周的泄殖腔棉拭樣品以及部分同步采集的雞舍內(nèi)外環(huán)境樣品(槽內(nèi)飼料、飲用水、墊料、地面擦拭樣品、飼養(yǎng)員鞋底擦拭樣品、周圍污水、土壤、空氣和蒼蠅等),用CCDA平板分離法對(duì)所有樣品進(jìn)行彎曲菌的分離培養(yǎng),多重PCR方法鑒定其種屬,同時(shí)用熒光定量PCR方法對(duì)泄殖腔棉拭子樣品進(jìn)行彎曲菌定量檢測(cè),以了解不同雞群養(yǎng)殖過程中彎曲菌的流行特點(diǎn)。結(jié)果顯示所有雞群均在2周齡后出現(xiàn)彎曲菌感染,雞群中一旦出現(xiàn)彎曲菌感染便會(huì)迅速傳播,最高感染率可達(dá)100%,最高帶菌量可達(dá)6.28 log cfu/g糞便;相同飼養(yǎng)模式下雞場(chǎng)B彎曲菌出現(xiàn)時(shí)間較雞場(chǎng)C滯后1～2周,雞群的初始帶菌量顯著低于雞場(chǎng)C(P0.05);籠養(yǎng)模式的雞場(chǎng)A其最高感染率低于平養(yǎng)模式的雞場(chǎng)B和C,其中A、B差異顯著(P0.01);同一雞場(chǎng)不同品種雞比較結(jié)果顯示MQ、W雞群3周齡時(shí)感染率顯著高于其相同雞場(chǎng)的其它雞群,高產(chǎn)黃肉種雞最高帶菌量顯著高于如皋草雞和MQ雞群(P0.05);雞群中空腸彎曲菌分離率高于結(jié)腸彎曲菌,且存在同一只雞混合感染空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的現(xiàn)象,最高混合感染率可達(dá)33%;環(huán)境樣品分離結(jié)果顯示,雞場(chǎng)A周圍污水和雞場(chǎng)C飼養(yǎng)員鞋底擦拭樣品分離率較高(21.5%、29.4%),其他樣品彎曲菌分離率較低(1.0%～8.3%);雞場(chǎng)A的空氣樣品、飼料樣品、飲水、風(fēng)扇擦拭及地面擦拭樣品、雞場(chǎng)C的污水均未分離到彎曲菌;結(jié)腸彎曲菌占據(jù)環(huán)境樣品分離株的91.5%(43/47)。自然感染雞血清彎曲菌抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示1日齡雛雞血清中含有一定的母源抗體,隨后抗體水平逐漸降低,2～3周齡達(dá)最低后又逐漸上升。以上研究為進(jìn)一步了解家禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)彎曲菌的流行傳播特點(diǎn),探索雞群中彎曲菌的可能來源提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。2雞養(yǎng)殖過程彎曲菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立為了解彎曲菌在雞養(yǎng)殖過程中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征,預(yù)測(cè)各雞群不同飼養(yǎng)階段彎曲菌的帶菌量,本研究在獲得部分雞群彎曲菌定量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,對(duì)養(yǎng)殖過程中雞體內(nèi)彎曲菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行研究,建立了 3個(gè)不同雞場(chǎng)6個(gè)雞群養(yǎng)殖過程中彎曲菌帶菌量與時(shí)間的關(guān)系曲線,結(jié)果顯示同一雞場(chǎng)的雞群具有相似的曲線特征,所有雞群在彎曲菌出現(xiàn)后1～2周其帶菌量達(dá)到峰值,隨后有下降的趨勢(shì)并有所波動(dòng)。如皋草雞雞群、麻雞、油雞雞群彎曲菌初始帶菌量在2.5 log cfu/g左右,而J+、J-、W雞群彎曲菌初始帶菌量為3～4 log cfU/g;如皋草雞雞群彎曲菌最高帶菌量小于4 log cfU/g,而其它雞群彎曲菌最高帶菌量均在5.5～61ogcfu/g。應(yīng)用MATLAB(R2015b)軟件對(duì)各雞群養(yǎng)殖過程中不同時(shí)間點(diǎn)彎曲菌實(shí)際帶菌量進(jìn)行擬合,獲得彎曲菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程為fx= b1+b2x2+b3√e xp(b4x2+b5xb6,該方程中fx為雞體內(nèi)彎曲菌帶菌量的對(duì)數(shù)值,x表示時(shí)間。b1、b1、b3、b4、b5、b6為方程的6個(gè)參數(shù),針對(duì)不同的雞群此方程中參數(shù)的取值不同。擬合結(jié)果顯示擬合到方程的曲線與雞群彎曲菌帶菌量的實(shí)測(cè)值較為吻合,可較好地描述雞群不同時(shí)間點(diǎn)彎曲菌帶菌量的變化趨勢(shì),應(yīng)用該方程可較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)進(jìn)入屠宰環(huán)節(jié)時(shí)雞群彎曲菌帶菌量。把握養(yǎng)殖過程中彎曲菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征可為農(nóng)場(chǎng)彎曲菌防控措施的制定提供參考,為雞養(yǎng)殖過程中彎曲菌定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ),同時(shí)可較方便地預(yù)測(cè)雞群進(jìn)入屠宰環(huán)節(jié)時(shí)的帶菌量,為屠宰前的分級(jí)處理提供便利。3基于MLST的雞養(yǎng)殖過程中彎曲菌傳播規(guī)律的分子流行病學(xué)研究為進(jìn)一步明確不同飼養(yǎng)階段雞群彎曲菌分離株的遺傳特性及不同來源分離株的遺傳相關(guān)性,了解彎曲菌在雞群中的傳播規(guī)律,本研究選取彎曲菌7個(gè)管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt、uncA,選擇雞養(yǎng)殖環(huán)節(jié)不同時(shí)間點(diǎn)和不同來源的代表性彎曲菌分離株220株(空腸彎曲菌76株,結(jié)腸彎曲菌144株)進(jìn)行MLST分型研究,結(jié)果顯示,220株分離株共分成23種不同的序列型,分屬7種同源復(fù)合體和獨(dú)特型;6種ST型(空腸彎曲菌5種,結(jié)腸彎曲菌1種)數(shù)據(jù)庫中未定義,屬于新序列型;各管家基因等位基因值的數(shù)量分析表明結(jié)腸彎曲菌中的gltA、aspA和uncA三個(gè)基因較為穩(wěn)定;空腸彎曲菌的優(yōu)勢(shì)序列型是ST-2140,優(yōu)勢(shì)克隆復(fù)合體是ST-574,結(jié)腸彎曲菌的優(yōu)勢(shì)序列型是ST-5506,優(yōu)勢(shì)克隆復(fù)合體是ST-828;—定飼養(yǎng)階段內(nèi)同一雞群不同時(shí)間點(diǎn)彎曲菌分離株ST型較一致,總體表現(xiàn)出較高的遺傳穩(wěn)定性,但同時(shí)也表現(xiàn)出遺傳多樣性;不同雞場(chǎng)彎曲菌分離株ST型分析表明以平養(yǎng)方式飼養(yǎng)的雞場(chǎng)B、C比以籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)的雞場(chǎng)A的分離菌株其ST型表現(xiàn)出更高的一致性;雞場(chǎng)不同來源彎曲菌ST型分析表明,環(huán)境樣品分離株的ST型與雞群泄殖腔棉拭子分離株的ST型一致,推測(cè)雞場(chǎng)A周圍污水是彎曲菌的重要儲(chǔ)庫,并有通過蒼蠅傳播的可能,雞場(chǎng)C彎曲菌有可能通過人員鞋底、飼料、飲水等進(jìn)行傳播,環(huán)境因素是雞群中彎曲菌的主要來源。以上研究為制定針對(duì)各雞場(chǎng)的彎曲菌防控措施提供了科學(xué)依據(jù)。4空腸彎曲菌亞單位候選疫苗的制備及其初步免疫評(píng)價(jià)為探索研制有效誘發(fā)雞體產(chǎn)生彎曲菌中和抗體并減少腸道內(nèi)彎曲菌定殖量的亞單位疫苗,本研究擴(kuò)增空腸彎曲標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11168 fliD基因并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pColdⅠ-fliD和pGEX-6p-1-fliD,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FLiD重組蛋白并進(jìn)行純化;Western-blot方法驗(yàn)證重組蛋白rHis-FLiD與His單抗的免疫反應(yīng)性。重組蛋白與法國(guó)Seppic公司生產(chǎn)的禽用礦物油佐劑Montanide乳化后肌肉注射7日齡、17日齡肉雞,經(jīng)兩次免疫后1周進(jìn)行109cfU/只雞空腸彎曲菌攻毒,于攻毒后3、7、11日齡分別宰殺部分雞只,采集盲腸組織及盲腸內(nèi)容物定量檢測(cè)其彎曲菌含量。采集1、17、24、27、31、35日齡各組雞血清,ELISA檢測(cè)血清中抗彎曲菌抗體含量。研究結(jié)果表明成功表達(dá)并純化rHis-FLiD重組蛋白,蛋白與His單抗具有較好的免疫反應(yīng)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二免后1周即24日齡時(shí)FLiD蛋白加佐劑免疫組血清抗體顯著高于對(duì)照組(P0.01),而空載體免疫組血清抗體與對(duì)照組相比無顯著差異;口服攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示,攻毒后11 d,FLiD蛋白加佐劑免疫組雞盲腸組織及盲腸內(nèi)容物彎曲菌含量顯著低于對(duì)照組(P0.01),與對(duì)照組相比均降低約4 log值,空載體免疫組與對(duì)照組相比無顯著差異。以上研究結(jié)果表明,FLiD蛋白與佐劑乳化后免疫雞可有效產(chǎn)生彎曲菌特異性血清抗體IgG,顯著降低口服攻毒雞盲腸內(nèi)容物及盲腸組織彎曲菌含量,具有一定的開發(fā)亞單位疫苗的前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31

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本文編號(hào)：1571567