本文選題：Tet1(Ten-eleven　切入點：translocation　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：奶山羊是我國重要的經(jīng)濟動物,保持和優(yōu)良奶山羊品種,實現(xiàn)快速繁殖是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的目標,奶山羊雄性生殖干細胞(male germline stem cell,mGSCs)自我更新的維持和發(fā)育分化的相關基礎性研究也逐步深入,家畜mGSCs體外培養(yǎng)體系不穩(wěn)定、重編程效率低等問題都亟待解決。研究表明表觀修飾在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調控作用。特定位點的DNA甲基化動態(tài)變化是維持正常精子發(fā)生的關鍵。Tet1(Ten-eleven translocation 1)作為主要的去甲基化酶,參與精子發(fā)生的表觀修飾調控進程。因此,開展mGSCs的表觀遺傳學研究,不僅有助于探究成體干細胞體外培養(yǎng)技術的優(yōu)化體系,推進mGSCs自我更新與分化機理的探索;而且在畜牧業(yè)生產(chǎn)上對提高優(yōu)良種畜的精子質量,減少疾病發(fā)生,促進家畜大動物優(yōu)良品種的遺傳與繁育有重要意義。本研究以奶山羊為研究對象,對Tet1及產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)進行表達譜和定位分析,同時探究了奶山羊精子發(fā)生過程中的dimethyl histone H3 lysine 9(H3K9me2)和tri-methyl H3 lysine 9(H3K9me3)在不同年齡階段睪丸組織的甲基化模式;利用Tet1過表達的方法修飾mGSCs并篩選陽性單細胞克隆,觀察細胞形態(tài)學、基因表達差異和DNA甲基化、組蛋白甲基化的變化;通過自發(fā)分化與體內(nèi)移植對Tet1過表達的mGSCs進行功能驗證,并分析Tet1與蛋白互作的調控機理。結果發(fā)現(xiàn):(1)Tet1在奶山羊睪丸組織中表達水平較低,且主要分布于曲細精管基底膜的精原細胞中;對其產(chǎn)物5hmC在不同年齡階段奶山羊睪丸組織中的含量與定位進行檢測,表明5hmC隨年齡增加而降低,且在mGSCs與支持細胞都有分布;奶山羊精子發(fā)生過程中的組蛋白H3K9me2在不同年齡階段睪丸組織呈現(xiàn)先升后降的模式,在青春期達到峰值;而H3K9me2含量則是隨年齡增長持續(xù)緩慢升高。成年睪丸組織中dimethyl histone H3 lysine 4(H3K4me2)定位于減數(shù)分裂后期的圓形精細胞,tri-methyl H3 lysine 27(H3K27me3)在mGSCs中呈現(xiàn)特殊的核周定位;在體外培養(yǎng)的mGSCs中,Tet1在維持自我更新的mGSCs中表達,在分化狀態(tài)下表達降低;5hmC與其表現(xiàn)同樣的趨勢;同時對體外培養(yǎng)的mGSCs中H3K9me2和H3K9me3進行檢測,發(fā)現(xiàn)維持自我更新的mGSCs克隆和趨于分化的克隆及未形成克隆的細胞相比含量含量較低。(2)生物信息學分析不同物種間Tet1基因的遺傳同源性和保守結構域,通過對Tet1基因共有的發(fā)揮功能關鍵的識別結構域和催化結構域進行分析,確定小鼠Tet1(mTet1)在山羊源細胞中發(fā)揮作用;篩選Dox誘導表達mTet1的陽性單細胞克隆,在基因、mRNA和蛋白水平進行鑒定后觀察細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)mTet1陽性細胞細胞核變大,且5hmC含量增加;通過階梯濃度培養(yǎng)確定0.50μg/mL的Dox濃度為最佳的誘導培養(yǎng)濃度;QRT-PCR、免疫熒光染色和western blot檢測發(fā)現(xiàn)mTet1陽性細胞中Gfra1、PCNA、CCND1、Ki67、ETV5等增殖和生殖特異性標志基因表達上調,分化特異性基因REC8表達下調;Tet1過表達的奶山羊mGSCs的陽性細胞,組蛋白甲基化相關的H3K9me2和H3K9me3含量有所下降,且H3K9me3由細胞核內(nèi)顆粒狀分布轉變?yōu)榫鶆蚍植?H3K27me3含量顯著降低,由細胞核內(nèi)均勻分布轉變?yōu)橄蚝酥芊植肌?3)構建過表達Tet1慢病毒載體,對篩選出的穩(wěn)定過表達Tet1的奶山羊mGSCs陽性克隆(mGSC-pCDH-mTet1)細胞進行QRT-PCR檢測,篩選出既能維持mGSCs自我更新又促進細胞增殖的克隆;制備mGSC-pCDH-mTet1細胞和mGSC-pCDH細胞的類胚體(EBs),自發(fā)分化試驗檢測體外分化能力,發(fā)現(xiàn)mGSC-pCDH-mTet1細胞自發(fā)分化后的細胞三胚層分化的速度較慢,說明mTet1具有維持自我更新、抑制分化的功能;對生殖缺陷小鼠模型進行mGSC-pCDH-mTet1細胞和mGSC-pCDH細胞的曲細精管移植,4周采集睪丸,制成石蠟切片,并進行PGP9.5、VASA、PCNA、Ki67等生殖與增殖相關特性標記的檢測,證實mGSC-pCDH-mTet1細胞在生殖缺陷小鼠的曲細精管內(nèi)不僅維持mGSCs的特性,還有顯著的增殖能力。(4)對mTet1在mGSCs中發(fā)揮作用的方式進行分析,確認mTet1通過上調組蛋白去甲基化酶JMJD3的表達,下調H3K27me3的含量并發(fā)生從核內(nèi)向核周分布的定位變化,此過程伴有MEK-ERK信號通路的抑制;mTet1通過與Hdac1形成蛋白復合體,共同調節(jié)組蛋白乙�；癄顟B(tài),進行mGSCs的表觀修飾調控;mTet1與PCNA形成蛋白復合體,通過mTet1過表達來促進mGSCs的增殖。綜上所述,本研究從體內(nèi)和體外分析了Tet1在奶山羊曲細精管和細胞中的分布;同時研究Tet1修飾引起的形態(tài)變化和基因調控機理。這不僅為精子發(fā)生過程中Tet1表達調控進一步的研究提供思路,為更深入探究表觀修飾調控在奶山羊mGSCs的發(fā)育與分化作用奠定了基礎。
[Abstract]:Dairy goat is an important economic animal in China, and maintain excellent dairy goat breeds, fast breeding is the modern agriculture, dairy goat male germline stem cells (male germline stem cell, mGSCs) on the self-renewal and differentiation of the relevant basic also gradually thorough, livestock mGSCs in vitro culture system is not stable reprogramming, low efficiency problems should be solved. The research showed that epigenetic modifications in spermatogenesis play an important role. Methylation sites of the DNA dynamic change is key to maintaining.Tet1 normal spermatogenesis (Ten-eleven translocation 1) as the main enzyme to methylation, participate in spermatogenesis of epigenetic modification the regulation process. Therefore, to carry out mGSCs epigenetic research not only helps to explore the training system optimization technology of adult stem cells in vitro, promote mGSCs self-renewal and differentiation mechanism Exploration; and in animal husbandry to improve sperm quality of breeding livestock, reduce disease, promote important genetic and breeding of fine varieties of livestock animal. In this study, the dairy goat as the research object, the Tet1 and 5- product hydroxymethylcytosine (5hmC) spectral analysis and positioning for expression, at the same time to explore the dairy goat during spermatogenesis of dimethyl histone H3 lysine 9 (H3K9me2) and tri-methyl H3 lysine 9 (H3K9me3) methylation patterns in the testis of different age stages; using Tet1 over expression method of modified mGSCs and screening of positive clones to observe the cell morphology, gene expression and DNA methylation changes. Histone methylation; through spontaneous differentiation and in vivo transplantation on expression of Tet1 mGSCs functional verification, and analyze the regulation mechanism of Tet1 and protein interaction. Results showed that: (1) Tet1 in dairy goats Testis tissue expression level is low, and is mainly distributed in the basal membrane of the seminiferous tubules of spermatogonial cells; to detect the content of the product and location of 5hmC in the testis of different age stages in dairy goats, showed that 5hmC reduced with the increase of age, and are distributed in mGSCs and Sertoli cells; goat in the process of spermatogenesis of histone H3K9me2 first increased and then decreased in testis of different age stages, and reached the peak in adolescence; while the content of H3K9me2 is continuously increased slowly with the growth of age. Adult testis tissue dimethyl histone H3 lysine 4 (H3K4me2) located in the postmeiotic round spermatid, tri-methyl H3 lysine 27 (H3K27me3) showed a perinuclear localization of particular in mGSCs; in mGSCs cultured in vitro. Tet1 expression in maintaining the self-renewal of mGSCs, reduce the expression of differentiation in 5hmC and its performance of the same state; The trend; at the same time. H3K9me2 and H3K9me3 mGSCs in vitro, found to maintain mGSCs self-renewal and cloning cloning tend to differentiation and did not form the cloned cells compared to content was lower. (2) analysis of Tet1 gene among species genetic homology and conserved domain of biological information analysis based on the Tet1 gene common play domain and the catalytic domain of the structure and function of the key identification, determination of mouse Tet1 (mTet1) play a role in goat derived cells; screening Dox positive single cell cloning, expression of mTet1 gene in induction, cell morphology was observed and identified by mRNA and protein levels, found that mTet1 positive nuclei become large increased, and the content of 5hmC; through the ladder concentration determine the Dox concentration of 0.50 g/mL for induction and the optimum concentration; QRT-PCR, immunofluorescence and Western blot detection found mTet1 positive cells The cell in Gfra1, PCNA, CCND1, Ki67, ETV5, proliferation and reproductive specific marker expression of differentiation specific gene REC8 expression; Tet1 positive cells expressed goat mGSCs, histone methylation of H3K9me2 and H3K9me3 content decreased, and H3K9me3 from the nucleus into a uniform distribution of particles distribution; H3K27me3 content decreased significantly, the nucleus uniform distribution into the nucleus. (3) construct Tet1 lentiviral expression vector, screened over expression of goat mGSCs positive clone Tet1 (mGSC-pCDH-mTet1) cells were detected by QRT-PCR. The selected mGSCs can maintain the self-renewal and promote cell cloning proliferation; preparation of mGSC-pCDH-mTet1 cells and mGSC-pCDH cells of the embryoid body (EBs), spontaneous differentiation differentiation assay in vitro, found that mGSC-pCDH-mTet1 cells spontaneously differentiated cells after three embryos Layer differentiation is slow, indicating that mTet1 has self-renewal and inhibits differentiation of seminiferous function; mGSC-pCDH-mTet1 cells and mGSC-pCDH cells of reproductive deficient mice transferred 4 weeks collecting testis, made of paraffin, and PGP9.5, VASA, PCNA, Ki67 detection and proliferation related markers reproductive characteristics. The characteristics showed that mGSC-pCDH-mTet1 cells in the seminiferous tube reproductive deficient mice not only maintain mGSCs, there is a significant proliferation. (4) of mTet1 play a role in mGSCs mode analysis, confirmed the expression of mTet1 through upregulation of histone demethylase JMJD3, downregulation of H3K27me3 content and changed from location within weeks of the nuclear nuclear distribution, inhibition of this process with the MEK-ERK signaling pathway by mTet1; and the formation of Hdac1 protein complex, CO regulation of histone acetylation modification, in the mGSCs table view The regulation of mTet1; and the formation of PCNA protein complex, expressed by mTet1 to promote the proliferation of mGSCs. In conclusion, this study analyzed the distribution of Tet1 in goat seminiferous tubules and cells in the in vivo and in vitro; morphological changes and gene regulation of Tet1 modified by the machine at the same time. This is not only in the process of spermatogenesis the expression of Tet1 to provide ideas for further research to further explore the regulation, epigenetic regulation in the development and differentiation of goat mGSCs laid the foundation.

【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S827

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本文編號：1558354