本文關(guān)鍵詞： 青蝦 家系構(gòu)建 生長特性 小RNA 蛋白質(zhì)組學(xué) 關(guān)聯(lián)分析 生長調(diào)控網(wǎng)絡(luò)　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：青蝦是長臂蝦科中有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的品種,其天然產(chǎn)量低,人工繁育難度很大,水產(chǎn)養(yǎng)殖中常缺乏規(guī)格整齊的優(yōu)質(zhì)速生青蝦苗。不能規(guī)模化繁殖苗種供應(yīng)市場需求成為青蝦人工養(yǎng)殖的限制因素之一,而傳統(tǒng)采用捕撈已抱卵野生雌蝦在土塘中自然繁殖的育苗方式,獲得的蝦苗品質(zhì)和產(chǎn)量較低。為了標(biāo)準(zhǔn)化培育優(yōu)質(zhì)青蝦苗,進(jìn)一步提高青蝦產(chǎn)量,深入研究其調(diào)控生長的分子機(jī)理,本研究從青蝦生長特性入手,以構(gòu)建的全同胞家系為實(shí)驗(yàn)材料,排除生長過程中環(huán)境因素對(duì)生長產(chǎn)生的影響,從組織學(xué)角度、核酸水平的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及小RNA組學(xué),進(jìn)而從蛋白水平的蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析,最后將各組學(xué)進(jìn)行聯(lián)合分析,由表及里的逐層對(duì)生長差異進(jìn)行分析,挖掘生長相關(guān)miRNA,最終獲得青蝦生長相關(guān)的主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為進(jìn)一步培育青蝦高產(chǎn)速生新品系提供參考。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)采用在水族箱中模擬青蝦全人工繁育的仿生態(tài)系統(tǒng),成功構(gòu)建了全同胞家系,為室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化育苗構(gòu)建青蝦家系用于后續(xù)的選擇育種提供了技術(shù)參考。(2)發(fā)現(xiàn)了與青蝦具親緣關(guān)系的長臂蝦科一個(gè)未命名新種,暫定名為彌河蝦,并對(duì)其家系構(gòu)建進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明,彌河蝦具備優(yōu)良生長特性,有望成為青蝦雜交改良的親本之一。選用70日齡的相同飼養(yǎng)條件下,且處于蛻殼間期的青蝦全同胞家系,以體長差異分為2組,FG組為生長快速者,SG組為生長慢速者,進(jìn)行如下研究:(3)組織學(xué)研究:以成年雄蝦和抱卵雌蝦的肝胰腺做參照,肝胰腺石蠟切片結(jié)果表明,FG組的肝胰腺細(xì)胞比SG組分化更快更完善,而SG組結(jié)締組織和胚性細(xì)胞較多,反映出兩組在營養(yǎng)攝入及消化效率中的差異,推測FG組代謝更旺盛;同時(shí),腹部肌肉的石蠟切片結(jié)果表明,FG組腹部肌肉橫切面的肌纖維直徑各參數(shù)均比SG組長,表明FG組的腹部肌肉生長速度更快。(4)轉(zhuǎn)錄組研究:以整只蝦提取總RNA,進(jìn)行基于High-seq 4000平臺(tái)的無參考基因組轉(zhuǎn)錄組測序以及基于High-seq 2500平臺(tái)的小RNA測序,對(duì)差異表達(dá)基因與差異miRNA分別進(jìn)行篩選、GO富集及KEGG通路分析,預(yù)測了DEM的靶基因,并對(duì)差異表達(dá)基因DEG與差異表達(dá)小RNA即DEM進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,進(jìn)而采用q RT-PCR方法對(duì)差異表達(dá)基因與miRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證。(1)無參考基因組轉(zhuǎn)錄組測序:FG組獲得22792166條clean reads,占總reads 97.33%;SG組獲得22534835條clean reads,占總reads 97.32%。在FG組與SG組中,共檢測到2739個(gè)基因顯著差異表達(dá)。以SG組為參照,FG組中有2116個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),有623個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。選取15個(gè)差異表達(dá)基因?qū)Ω咄繙y序結(jié)果進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致,兩者具有很強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.901)。(2)小RNA測序:在兩組中共檢測到592個(gè)差異表達(dá)的miRNA(含新發(fā)現(xiàn)的miRNA),其中有457個(gè)miRNA在兩個(gè)樣品中共同表達(dá),有68個(gè)僅在FG組中表達(dá),有67個(gè)僅在SG組中表達(dá)。另外,發(fā)現(xiàn)了84個(gè)差異表達(dá)的新miRNA,有15個(gè)新miRNA僅在FG組中表達(dá),有18個(gè)新miRNA僅在SG組中表達(dá)。選取11個(gè)miRNA進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與高通量測序結(jié)果基本一致,相關(guān)系數(shù)為R2=0.972。(3)轉(zhuǎn)錄組與小RNA測序的關(guān)聯(lián)分析:關(guān)聯(lián)到14個(gè)主要的差異miRNA(上調(diào)表達(dá)5個(gè)、下調(diào)表達(dá)9個(gè),包含2個(gè)全新的miRNA序列novel_22和novel_51),5個(gè)上調(diào)miRNA對(duì)45個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因具有調(diào)控作用,9個(gè)下調(diào)miRNA對(duì)137個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因具有調(diào)控作用。(5)蛋白組研究:為了從蛋白水平檢驗(yàn)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)差異,取用同家系同批次青蝦,采用Velos Pro離子阱與高場Orbitrap技術(shù)相結(jié)合的Thermo Scientific Orbitrap Elite組合式質(zhì)譜儀,對(duì)FG組與SG組的總蛋白酶解肽段,做質(zhì)譜分析,質(zhì)譜信息以轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)預(yù)測出的氨基酸庫為比對(duì)庫進(jìn)行搜庫注釋,以Max fold change≥2與Anova p-value≤0.05為限制篩選條件,篩選到生長快速組有8個(gè)蛋白表達(dá)比慢速組顯著升高,有104個(gè)蛋白表達(dá)比慢速組顯著降低。轉(zhuǎn)錄組、小RNA與蛋白質(zhì)組的聯(lián)合分析,獲得了調(diào)控青蝦生長的3條調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。聯(lián)合分析結(jié)果表明:青蝦全同胞家系的生長差異是由于快慢兩組間基因轉(zhuǎn)錄效率的差異以及由酶類催化的代謝差異造成的,該過程受相關(guān)miRNA的調(diào)控。獲得的3條青蝦生長相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式為:網(wǎng)絡(luò)模式1:由sha-miR-21調(diào)控靶基因CFL,作用于肌動(dòng)蛋白解聚因子(cofilin/actin-depolymerizing factor)的表達(dá),推測其在青蝦肌肉發(fā)育中起正調(diào)控作用。網(wǎng)絡(luò)模式2:由sha-miR-21和hsa-miR-21-5p共同調(diào)控靶基因MCCC1的同源基因,影響β-甲基丁烯酰輔酶A羧化酶(methylcrotonoyl-Co A carboxylase)的表達(dá),調(diào)控纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑,推測其在青蝦生長中對(duì)氨基酸的利用速率中起主要的正調(diào)控作用,促進(jìn)青蝦生長。網(wǎng)絡(luò)模式3:由新的miRNA成員novel_22調(diào)控靶基因Tspst的同源基因,作用于蛋白酶體β7亞基(proteasome subunit beta type-7),調(diào)控泛素蛋白酶體途徑,推測其在青蝦生長中對(duì)蛋白降解速率起主要調(diào)控作用,其蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí),利于同化作用,正調(diào)控青蝦生長。sha-miR-21同時(shí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式1和網(wǎng)絡(luò)模式2,形成由氨基酸代謝關(guān)聯(lián)肌肉生長的網(wǎng)絡(luò),在全同胞家系的生長中起重要作用�？傊�,本研究成功構(gòu)建了青蝦全同胞家系,從組織學(xué)角度及m RNA、miRNA和蛋白質(zhì)組學(xué)角度,系統(tǒng)研究了排除環(huán)境影響后,青蝦全同胞家系生長差異的分子生物學(xué)機(jī)理,獲得了3條調(diào)控青蝦生長的網(wǎng)絡(luò),為培育青蝦速生家系提供重要參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1553559