發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 10:58

  本文關(guān)鍵詞： Toxoplasma gondii TALEN CRISPR-Cas9 基因敲除 DNA疫苗 表達(dá)調(diào)控　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們對于基因的研究越來越透徹,基于基因的遺傳改造技術(shù)也取得了飛速的發(fā)展。從ZFN到TALEN再到后來的CRISPR技術(shù),短短八年時(shí)間,DNA靶向技術(shù)便經(jīng)歷了幾次大的變革。由此也引發(fā)了以弓形蟲為模式生物的頂復(fù)門寄生蟲基因研究的技術(shù)突破。弓形蟲是一種專性胞內(nèi)寄生的原蟲,可引起嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病,給人類的生育健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)重的危害。盡管關(guān)于弓形蟲的基礎(chǔ)研究已經(jīng)取得了一定的成果,但在致病機(jī)制等方面仍知之甚少。這些新興的遺傳操作技術(shù)為此帶來了突破的機(jī)會。本研究首先應(yīng)用TALEN技術(shù)針對入侵的關(guān)鍵因子RON2進(jìn)行移碼突變,隨后以DNA疫苗的形式對其各功能區(qū)進(jìn)行免疫保護(hù)性驗(yàn)證;然后利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)比較分析GRA7,ROP17,ROP18在本地分離株(T.g HB1)的毒力作用;構(gòu)建了調(diào)控弓形蟲基因轉(zhuǎn)錄的CRISPR-d Cas9抑制表達(dá)系統(tǒng)。1.TALEN技術(shù)介導(dǎo)的RON2的功能失活及RON2各功能域的免疫保護(hù)力驗(yàn)證根據(jù)RON2基因序列設(shè)計(jì)DNA靶點(diǎn)識別域,并構(gòu)建相應(yīng)的TALEN質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染后根據(jù)RFP和GFP雙熒光信號對蟲體進(jìn)行篩選驗(yàn)證,以PCR和測序的方法鑒定靶點(diǎn)結(jié)合域的序列突變。結(jié)果顯示TALEN質(zhì)粒成功誘導(dǎo)了RON2的移碼突變,但由于RON2的功能缺失導(dǎo)致蟲體入侵受阻,未分離到單克隆蟲株。對RON2基因功能域進(jìn)行分析,分別構(gòu)建了三個(gè)pc DNA3.1-RON2(1/2/3)真核表達(dá)質(zhì)粒,以100μg/只小鼠的劑量分別于0 d,14 d,28 d,42 d進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示,RON2-1/2/3均刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IFN-γ,但僅有RON2-3免疫組對小鼠有16.7%的免疫保護(hù)力。結(jié)果證實(shí),RON2的胞外結(jié)構(gòu)域可作為疫苗候選分子用于弓形蟲疫苗的研究。2.CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的HB1弓形蟲毒力相關(guān)因子的敲除首先,分別構(gòu)建識別GRA7,ROP17,ROP18的CRISPR-Cas9-sg RNA質(zhì)粒和用于同源重組修復(fù)的質(zhì)粒(含GFP、DHFR*或CAT篩選標(biāo)記);轉(zhuǎn)染后的蟲體經(jīng)診斷PCR、Western-blot等鑒定最終獲得△GRA7、△ROP17、△ROP18、△GRA7△ROP17、△GRA7△ROP18五個(gè)敲除蟲株;通過空斑實(shí)驗(yàn)和小鼠攻蟲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲除蟲株的生物學(xué)特性。最終空斑結(jié)果表明五個(gè)突變株在體外培養(yǎng)過程中與野生型沒有生長速度上的明顯差異;攻蟲結(jié)果顯示△GRA7、△ROP17、△ROP18表現(xiàn)出不同程度的毒力下降,△GRA7△ROP17、△GRA7△ROP18表現(xiàn)出與△ROP17、△ROP18相似的毒力下降。結(jié)果表明GRA7,ROP17和ROP18等毒力因子在HB1株中發(fā)揮重要的毒力作用,與RH株致病模式存在差異。3.基于CRISPR-d Cas9系統(tǒng)對弓形蟲SAG1啟動(dòng)子的抑制調(diào)控利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)以SAG1P::RFP-SAG13’替代UPRT構(gòu)建一株穩(wěn)定表達(dá)RFP的弓形蟲蟲株;通過缺失切割活性的d Cas9和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(KRAB)來構(gòu)建CRISPR-d Cas9抑制系統(tǒng);構(gòu)建多個(gè)識別SAG1啟動(dòng)子的CRISPR-d Cas9質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控試驗(yàn),通過熒光鏡檢的方法對SAG1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示,sg RNA結(jié)合在SAG1啟動(dòng)子-316至-297 bp處,p CRISPR-d Cas9-KRAB-sg SAG1的結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對弓形蟲內(nèi)源基因SAG1和外源基因RFP的顯著抑制。本研究通過TALEN技術(shù)誘導(dǎo)了RON2的移碼突變,證實(shí)了RON2不可替代,并通過DNA疫苗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RON2作為疫苗候選分子的可能;利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)驗(yàn)證了GRA7,ROP17,ROP18在HB1弓形蟲中的毒力作用;構(gòu)建了適用于弓形蟲基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制工具——CRISPR-d Cas9系統(tǒng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S855.9

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本文編號：1537727