本文關鍵詞： Toxoplasma gondii TALEN CRISPR-Cas9 基因敲除 DNA疫苗 表達調控　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：隨著分子生物學技術的發(fā)展,人們對于基因的研究越來越透徹,基于基因的遺傳改造技術也取得了飛速的發(fā)展。從ZFN到TALEN再到后來的CRISPR技術,短短八年時間,DNA靶向技術便經(jīng)歷了幾次大的變革。由此也引發(fā)了以弓形蟲為模式生物的頂復門寄生蟲基因研究的技術突破。弓形蟲是一種專性胞內寄生的原蟲,可引起嚴重的人畜共患寄生蟲病,給人類的生育健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴重的危害。盡管關于弓形蟲的基礎研究已經(jīng)取得了一定的成果,但在致病機制等方面仍知之甚少。這些新興的遺傳操作技術為此帶來了突破的機會。本研究首先應用TALEN技術針對入侵的關鍵因子RON2進行移碼突變,隨后以DNA疫苗的形式對其各功能區(qū)進行免疫保護性驗證;然后利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)比較分析GRA7,ROP17,ROP18在本地分離株(T.g HB1)的毒力作用;構建了調控弓形蟲基因轉錄的CRISPR-d Cas9抑制表達系統(tǒng)。1.TALEN技術介導的RON2的功能失活及RON2各功能域的免疫保護力驗證根據(jù)RON2基因序列設計DNA靶點識別域,并構建相應的TALEN質粒;轉染后根據(jù)RFP和GFP雙熒光信號對蟲體進行篩選驗證,以PCR和測序的方法鑒定靶點結合域的序列突變。結果顯示TALEN質粒成功誘導了RON2的移碼突變,但由于RON2的功能缺失導致蟲體入侵受阻,未分離到單克隆蟲株。對RON2基因功能域進行分析,分別構建了三個pc DNA3.1-RON2(1/2/3)真核表達質粒,以100μg/只小鼠的劑量分別于0 d,14 d,28 d,42 d進行免疫。結果顯示,RON2-1/2/3均刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IFN-γ,但僅有RON2-3免疫組對小鼠有16.7%的免疫保護力。結果證實,RON2的胞外結構域可作為疫苗候選分子用于弓形蟲疫苗的研究。2.CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導的HB1弓形蟲毒力相關因子的敲除首先,分別構建識別GRA7,ROP17,ROP18的CRISPR-Cas9-sg RNA質粒和用于同源重組修復的質粒(含GFP、DHFR*或CAT篩選標記);轉染后的蟲體經(jīng)診斷PCR、Western-blot等鑒定最終獲得△GRA7、△ROP17、△ROP18、△GRA7△ROP17、△GRA7△ROP18五個敲除蟲株;通過空斑實驗和小鼠攻蟲實驗驗證敲除蟲株的生物學特性。最終空斑結果表明五個突變株在體外培養(yǎng)過程中與野生型沒有生長速度上的明顯差異;攻蟲結果顯示△GRA7、△ROP17、△ROP18表現(xiàn)出不同程度的毒力下降,△GRA7△ROP17、△GRA7△ROP18表現(xiàn)出與△ROP17、△ROP18相似的毒力下降。結果表明GRA7,ROP17和ROP18等毒力因子在HB1株中發(fā)揮重要的毒力作用,與RH株致病模式存在差異。3.基于CRISPR-d Cas9系統(tǒng)對弓形蟲SAG1啟動子的抑制調控利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)以SAG1P::RFP-SAG13’替代UPRT構建一株穩(wěn)定表達RFP的弓形蟲蟲株;通過缺失切割活性的d Cas9和轉錄調節(jié)因子(KRAB)來構建CRISPR-d Cas9抑制系統(tǒng);構建多個識別SAG1啟動子的CRISPR-d Cas9質粒進行轉錄調控試驗,通過熒光鏡檢的方法對SAG1的轉錄活性進行評價。結果顯示,sg RNA結合在SAG1啟動子-316至-297 bp處,p CRISPR-d Cas9-KRAB-sg SAG1的結合可實現(xiàn)對弓形蟲內源基因SAG1和外源基因RFP的顯著抑制。本研究通過TALEN技術誘導了RON2的移碼突變,證實了RON2不可替代,并通過DNA疫苗實驗驗證了RON2作為疫苗候選分子的可能;利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)驗證了GRA7,ROP17,ROP18在HB1弓形蟲中的毒力作用;構建了適用于弓形蟲基因表達調控的轉錄抑制工具——CRISPR-d Cas9系統(tǒng)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S855.9

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本文編號：1537727