本文關(guān)鍵詞： 牛帶絳蟲 轉(zhuǎn)錄組 密碼子 乙酰膽堿酯酶 畢赤酵母表達系統(tǒng) 同源模建 配體虛擬篩選　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：牛帶絳蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲。成蟲寄生蟲于人體引起絳蟲病,幼蟲則寄生于牛的橫紋肌內(nèi)引起牛囊尾蚴病。據(jù)統(tǒng)計,全球每年大約有5000萬人被牛帶絳蟲感染,主要集中在非洲、中東地區(qū)、亞洲、歐洲的一些國家。該病原給全球畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟損失巨大,也對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。目前,由于牛帶絳蟲的可用的生物分子數(shù)據(jù)較少,大大限制了人們對該病原的科學研究和新型藥物的開發(fā)。本論文對該絳蟲進行了轉(zhuǎn)錄組測序,并以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)開展了相關(guān)工作。1.利用Illimina Hi Seq TM2000第二代測序技術(shù)對牛帶絳蟲囊尾蚴進行了轉(zhuǎn)錄組測序。測序共獲得了52829606高質(zhì)量序列,并通過拼接組裝得到了91487條Unigene(平均長度為2122bp)。利用幾種蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(Nr,Swiss-prot,GO,COG和KEGG數(shù)據(jù)庫)對Unigene進行了注釋。結(jié)果顯示,共有59262條Unigene(占總Unigene數(shù)量的64.77%)得到了功能注釋。同時,我們鑒定出了大量的分子標記,包括12902個SNP(single-nucleotide polymorphisms)位點和10017個SSR(simple sequence repeats)序列.2.利用測序獲得的牛帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和其他五種絳蟲(豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲、微口膜殼絳蟲、細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲)的基因組數(shù)據(jù),我們對六種絳蟲的密碼子使用模式和影響因素進行了比較分析。結(jié)果顯示,除了微口膜殼絳蟲外,其他五種絳蟲具有相似的密碼子使用模式,這些絳蟲的密碼子都傾向于G或C結(jié)尾。相反,微口膜殼絳蟲基因的密碼子第三位傾向于以A或T結(jié)尾。ENC-plot、PR2和中性分析結(jié)果表明六種絳蟲在進化過程中受到了突變和自然選擇兩種壓力。除了這兩種壓力外,六種絳蟲的密碼子使用偏性還受到了GC含量、基因表達水平、基因長度和編碼蛋白的親水性及芳香性等多種因素的影響。通過卡方檢驗,我們鑒定出了每種絳蟲的最優(yōu)密碼子,這些密碼子對于外源基因表達、分子進化研究具有重要意義。3.通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出對其生長發(fā)育至關(guān)重要的乙酰膽堿酯酶基因,并對其進行了克隆和畢赤酵母表達等一系列工作。序列分析表明,ACh E1和ACh E2基因編碼的氨基酸序列與豬帶絳蟲ACh E氨基酸序列相似性最高,均在80%以上,而與人類的ACh E基因序列相似性僅有37%,這種寄生蟲與宿主之間的基因序列顯著差異將有助于開發(fā)新的治療絳蟲病的藥物。熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示,ACh E1和ACh E2基因在成蟲和囊尾蚴時期均有表達,且成蟲時期表達量更高。將純化后的重組蛋白ACh E1和ACh E2免疫新西蘭大白兔,制備多抗進行組織定位,結(jié)果表明,ACh E1和ACh E2主要分布在卵巢,而在間質(zhì)以及體壁中分布不明顯,表明乙酰膽堿酯酶與蟲體的生殖發(fā)育相關(guān)。酶活性分析顯示,當重組酶的濃度為0.5 mg/m L,底物濃度為0.8 mmol/L,p H為7,溫度為35℃時,酶活性最高。4.采用同源模建的方法對牛帶絳蟲乙酰膽堿酯酶結(jié)構(gòu)進行了預測,然后基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法對牛帶絳蟲乙酰膽堿酯酶抑制劑進行了篩選,得到了15個具有潛在ACh E抑制活性的小分子化合物(ACh E1和ACh E2各15個),這些小分子結(jié)構(gòu)相似,多數(shù)為狹長結(jié)構(gòu),并含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)、疏水基團和氮原子、氯原子和溴原子等,主要以氫鍵、π-π堆積和疏水作用與酶活性部位結(jié)合。
[Abstract]:鐗涘甫緇﹁櫕鏄竴縐嶉噸瑕佺殑浜哄吔鍏辨?zhèn)ｅ瘎鐢熻櫍?

本文編號：1523921