本文關(guān)鍵詞： 自噬 RABV N P BECN1 CASP2 信號(hào)通路　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自噬是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)過程,是組織維持穩(wěn)定和發(fā)育必須的,自噬或自噬基因在病毒生命周期中既發(fā)揮抗病毒又發(fā)揮促病毒的作用。然而,至今還沒有RABV與細(xì)胞自噬關(guān)系的系統(tǒng)性研究。本研究立足基礎(chǔ)理論,以小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a為研究對(duì)象,探索RABV感染與宿主細(xì)胞自噬的關(guān)系。采用激光共聚焦,免疫印跡,藥物處理,RNA干擾以及免疫共沉淀等方法探索RABV感染對(duì)細(xì)胞自噬的影響。激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源性GFP-LC3在HEP-Flury、CVS-11感染的12 h、24 h、36 h、48 h自噬泡均由點(diǎn)狀聚集成團(tuán),總的內(nèi)源性LC3在16 h、24 h與RABV的N蛋白有顯著共定位,且聚集成大的團(tuán)塊狀;同時(shí)通過免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RABV感染4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h內(nèi)源性LC3-Ⅱ型也均上調(diào)表達(dá),但SQSTM1的變化不明顯。同時(shí),我們利用ICR昆明乳鼠進(jìn)行體內(nèi)攻毒感染實(shí)驗(yàn),經(jīng)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病毒感染鼠腦內(nèi)源性LC3-Ⅱ具有顯著差異,而SQSTM1水平?jīng)]有差異變化。除此之外,我們進(jìn)一步通過激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病毒感染導(dǎo)致自噬泡和溶酶體不融合。為了闡釋自噬對(duì)RABV感染的影響,免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自噬激活劑EBSS/Rapa和抑制劑wortmannin/3-MA以及shRNA處理后,自噬增強(qiáng)有利于病毒轉(zhuǎn)錄,蛋白翻譯以及病毒釋放水平,而抑制自噬則降低了相應(yīng)的水平。這些結(jié)果表明,RABV利用誘導(dǎo)的不完全自噬在宿主細(xì)胞中進(jìn)行病毒自身的復(fù)制。為了闡明RABV誘導(dǎo)的不完全自噬反應(yīng)是否是由病毒蛋白引起的,我們對(duì)RABV各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)自噬的影響進(jìn)行分析。我們?cè)贜2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)病毒蛋白的質(zhì)粒Flag-N/P/M/G/L,通過激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只有病毒N/P蛋白能誘發(fā)外源性GFP-LC3的大的團(tuán)塊狀聚集,同時(shí)發(fā)現(xiàn)N/P蛋白能夠增強(qiáng)總的內(nèi)源性LC3的表達(dá)。進(jìn)一步通過免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的LC3-Ⅱ水平均顯著上調(diào),而SQSTM1水平?jīng)]有顯著變化。同樣地,為了驗(yàn)證病毒感染抑制自噬泡和溶酶體的融合,是否是由某種病毒蛋白引起的,我們共轉(zhuǎn)染GFP-LC3和Flag-N/P,激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病毒N/P均抑制了自噬泡和溶酶體融合。為了進(jìn)一步檢測(cè)P蛋白對(duì)自噬的影響,免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)P蛋白N端1-222位氨基酸是誘導(dǎo)不完全自噬的關(guān)鍵區(qū)域。這些結(jié)果表明,N/P蛋白是誘發(fā)不完全自噬的關(guān)鍵蛋白。為了進(jìn)一步闡明RABV誘發(fā)不完全自噬的信號(hào)通路機(jī)制,我們利用遺傳干擾手段,通過免疫印跡和激光共聚焦技術(shù)探索RABV感染誘導(dǎo)不完全自噬形成的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RABV感染抑制CASP2的表達(dá),并激活A(yù)KT和MTOR磷酸化水平,同時(shí)也激活下游AMPK,ERK1/2,P38磷酸化水平。敲低AKT-MTOR、AMPK、MAPK信號(hào)通路元件,過表達(dá)CASP2,發(fā)現(xiàn)CASP2作為這些通路的上游分子元件介導(dǎo)AMPK-MAPK/AKT-MTOR級(jí)聯(lián)信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)了不完全自噬反應(yīng)。同時(shí)通過免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)N、P蛋白能夠激活CASP2介導(dǎo)的信號(hào)通路,而且免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)P蛋白能夠和BECN1互作。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BECN1-P蛋白互作是否誘導(dǎo)CASP2依賴信號(hào)通路,免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲低BECN1聯(lián)合轉(zhuǎn)染P蛋白或病毒感染情況下顯著抑制CASP2依賴的信號(hào)通路。這些結(jié)果表明BECN1結(jié)合P蛋白介導(dǎo)CASP2依賴的信號(hào)通路。綜上所述,我們綜合利用細(xì)胞生物學(xué),免疫學(xué),分子生物學(xué),生物化學(xué)等多種手段對(duì)RABV感染誘導(dǎo)不完全自噬的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,結(jié)果表明,RABV感染誘發(fā)的不完全自噬是經(jīng)P蛋白和BECN1結(jié)合導(dǎo)致CASP2介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路參與激活A(yù)MPK-MAPK/AKT-MTOR,從而有利于RABV的復(fù)制,為進(jìn)一步研究RABV感染特性以及致病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to elucidate the effect of autophagy on RABV infection , the effect of RABV infection on the autophagy of the host cells was investigated . In order to further clarify the mechanism of RABV - induced incomplete autophagy , it was found that N / P protein was the key protein to induce incomplete autophagy .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1511013