本文關(guān)鍵詞： 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) 類彈性蛋白 柯薩奇腺病毒受體 重組腺病毒 人溶菌酶 牛γ干擾素　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腺病毒(adeno virus, Ad)載體具有感染宿主范圍廣、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高和不易引起插入突變等優(yōu)點(diǎn),因此廣泛應(yīng)用作基因治療和基因工程疫苗的載體,但現(xiàn)有的重組腺病毒制備方法具有費(fèi)時(shí)、成本高、不易規(guī)模化等缺點(diǎn)。受體結(jié)合捕獲(receptor-binding capture)技術(shù)能從組織和環(huán)境樣品中濃縮病毒,將其與PCR等技術(shù)相結(jié)合可用于病毒的濃縮和環(huán)境監(jiān)測(cè)。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一種人工合成的蛋白聚合物,具有溫度敏感相變特性,即隨著溶液溫度的變化由可溶性狀態(tài)變?yōu)椴豢扇苣蹱顟B(tài),已廣泛用作重組蛋白的純化標(biāo)簽。將ELP的溫度敏感相變特性與柯薩奇病毒-腺病毒受體(coxsachievirus and adenovirus receptor, CAR)結(jié)合腺病毒的特異性相結(jié)合,用重組大腸桿菌表達(dá)的ELP-CAR融合蛋白有望建立簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的腺病毒濃縮與純化方法。奶牛乳房炎嚴(yán)重地制約著奶牛業(yè)的發(fā)展,目前一般采用抗生素防治。但奶牛乳房炎的病原種類復(fù)雜,中小型奶牛場(chǎng)一般不進(jìn)行病原菌鑒定和藥物敏感性檢測(cè),長(zhǎng)期、盲目使用抗生素不僅治療效果不佳,而且藥物殘留和耐藥菌株日益嚴(yán)重。溶菌酶是一種細(xì)胞壁溶解酶,對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌具有直接溶菌作用,在補(bǔ)體等體液因子參與下對(duì)革蘭氏陰性菌也有一定的溶菌作用,表達(dá)溶菌酶的重組質(zhì)粒對(duì)奶牛乳房炎具有良好的防治效果。γ干擾素(IFN-γ)是一種高活性、多功能細(xì)胞因子,能提高機(jī)體的免疫和抗感染能力,重組大腸桿菌表達(dá)的牛丫干擾素對(duì)奶牛乳房炎也有一定的治療效果。因此,溶菌酶與BoIFN-γ共表達(dá)重組腺病毒對(duì)奶牛乳房炎可能具有更好的治療效果。一、ELP-CAR融合蛋白的表達(dá)與純化：依次將ELP、CAR間隔區(qū)和CAR D1區(qū)編碼序列插入原核表達(dá)載體pET-30a,將重組質(zhì)粒pET-ELP-CAR轉(zhuǎn)化BLR(DE3)大腸桿菌,在20℃利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),在優(yōu)化條件下利用ELP的溫度敏感逆向相變循環(huán)(ITC)純化融合蛋白。結(jié)果顯示：ELP-CAR融合蛋白在重組大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá),第一輪逆向相變循環(huán)獲得的融合蛋白純度為89.4%,再次逆向相變循化后的純度達(dá)94.5%。Western-blot鑒定結(jié)果顯示：純化的ELP-CAR融合蛋白能被CAR抗體識(shí)別。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究成功純化出了ELP-CAR融合蛋白。二、腺病毒快速濃縮與純化方法的建立：將rAd-GFP與ELP-CAR融合蛋白混合,4℃孵育1h后用ITC沉淀,經(jīng)PCR檢測(cè)證明rAd-GFP能被ELP-CAR融合蛋白結(jié)合和沉淀。將不同濃度ELP-CAR融合蛋白與rAd-GFP在不同溫度、pH條件下孵育不同時(shí)間,用ITC回收結(jié)合的rAd-GFP,病毒滴定結(jié)果顯示120mg/ml的ELP-CAR與rAd-GFP在18℃、pH7.0孵育30min的結(jié)合效率最佳。將結(jié)合融合蛋白的rAd-GFP在不同溫度、pH條件下洗脫不同時(shí)間,病毒滴定結(jié)果顯示最佳洗脫條件為20℃、 pH9.0、10min。在優(yōu)化條件下分別從rAd-GFP感染細(xì)胞培養(yǎng)上清和裂解細(xì)胞中純化重組腺病毒,結(jié)果顯示rAd-GFP的獲得率分別為76.2%和73.3%。在優(yōu)化條件下洗脫從rAd-GFP感染細(xì)胞培養(yǎng)上清和裂解細(xì)胞純化的rAd-GFP,結(jié)果顯示回收率分別30.6%和34.5%,與高壓液相色譜和氯化銫密度梯度的回收率相當(dāng)。分別用結(jié)合ELP-CAR融合蛋白和洗脫的rAd-GFP感染CAR陽(yáng)性PK-15細(xì)胞、CAR弱陽(yáng)性CHO-K1細(xì)胞和CAR陰性NIH 3T3細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示洗脫和未洗脫重組腺病毒均能感染PK-15和CHO-K1細(xì)胞,不能感染NIH 3T3細(xì)胞。用含或不含10%犢牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋洗脫和未洗脫重組腺病毒,分別感染PK-15和CHO-K1細(xì)胞,流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果表明洗脫和未洗脫重組腺病毒均能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15細(xì)胞,而且受犢牛血清的影響較�。粚�(duì)于CHO-K1細(xì)胞,洗脫腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于未洗脫重組腺病毒,而且受犢牛血清的影響較大。將不同濃度rAdv-GFP接種自來(lái)水和PBS,然后加入ELP-CAR融合蛋白,孵育一定時(shí)間后用ITC回收,熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明ELP-CAR融合蛋白從PBS和自來(lái)水中捕獲病毒的效率分別為74%和63%。三、雙表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建：用化學(xué)合成或PCR擴(kuò)增腦心肌炎病毒(EMCV)、Gtx同源異型蛋白(Gtx)、人蛋白翻譯起始因子4G (EIF4G)、人膠原誘導(dǎo)蛋白(hVCIP)和鼠膠原誘導(dǎo)蛋白(mVCIP)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES),測(cè)序鑒定正確后分別插入腺病毒載體pShuttle-CMV,構(gòu)建獲得雙表達(dá)腺病毒載體pShuttle-IRES.分別以含人溶菌酶(hLYZ)和綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組質(zhì)粒為模板,用PCR擴(kuò)增LYZ和GFP基因,分別插入pShuttle-IRES載體IRES位點(diǎn)的上游和下游,獲得5種重組載體pShuttle-LYZ-IRES-GFP。分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將5種重組載體轉(zhuǎn)染PK15、AAV-293、 CHO-K1和MDBK細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞及熒光強(qiáng)度,結(jié)果表明EIF4G IRES能在四種不同細(xì)胞中有效表達(dá)下游GFP基因。四、溶菌酶與γ干擾素共表達(dá)重組腺病毒的制備及表達(dá)檢測(cè)：根據(jù)BoIFN-y編碼序列設(shè)計(jì)引物,兩端分別引入XhoⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn),以pGEX-IFNγ質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增BoIFN-γ序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ酶切消化后,取代pShuttle-LYZ-EIRES-GFP中的GFP編碼序列,獲得共表達(dá)重組腺病毒載體pShuttle-LYZ-EIRES-IFNy,用常規(guī)構(gòu)建方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得同源重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞獲得重組腺病毒。電鏡觀察結(jié)果表明：重組病毒rAd-LYZ-IRES-IFN具有典型的腺病毒形態(tài),PCR能從其基因組DNA中擴(kuò)增到預(yù)期的461 bp hLYZ基因片段和509bp BoIFN-y基因片段。用重組腺病毒感染PK-15細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光法檢測(cè)證明,重組腺病毒能正確表達(dá)hLYZ和BoIFNy蛋白。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：1490241