本文關(guān)鍵詞： 龔地弓形蟲 半胱氨酸蛋白酶(Metacaspases) 功能 分裂 內(nèi)膜復(fù)合體 機(jī)制　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii,簡稱弓形蟲)寄生于溫血動物和人的有核細(xì)胞,是重要的人獸共患病原。在對弓形蟲體內(nèi)及體外研究中均觀察到速殖子的凋亡現(xiàn)象,但引發(fā)弓形蟲凋亡的相關(guān)因子和機(jī)制尚未見報(bào)道。大量研究顯示,一類以組氨酸和半胱氨酸為催化位點(diǎn)的半胱氨酸水解酶-Metacaspases在植物、真菌及原蟲中具有參與凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期和降解錯(cuò)誤折疊蛋白等重要功能。我們利用數(shù)據(jù)庫搜索比對發(fā)現(xiàn)弓形蟲中存在三個(gè)Metacaspases(MCAs),分別命名為TgMCA1、TgMCA2和TgMCA3,三者的功能均未見報(bào)道。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),MCA1與釀酒酵母同源蛋白YCA1相似性達(dá)49%,且具有組氨酸和半胱氨酸組成催化活性位點(diǎn);MCA2的半胱氨酸相鄰的組氨酸和MCA3的組氨酸均有突變。我的博士論文對MCA1和MCA2進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究。我們首先觀察了 MCA1的表達(dá)和定位,發(fā)現(xiàn)弓形蟲速殖子能夠表達(dá)MCA1,其定位于胞內(nèi)蟲體的胞質(zhì)中;當(dāng)蟲體釋放至胞外,MCA1由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移并最終聚集于蟲體胞核;當(dāng)弓形蟲發(fā)生分裂時(shí),MCA1定位于子代蟲體的內(nèi)膜復(fù)合體。為了進(jìn)一步研究MCA1的功能,我們利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了弓形蟲MCA1基因缺失株(△mca1)和過表達(dá)株(mca1-OE)。對不同調(diào)控蟲株進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)△mca1的增殖能力與母源株Aku80無明顯差異;mca1-OE的增殖能力下降,蟲體胞質(zhì)分裂延遲,推測MCA1可能參與調(diào)控蟲體分裂。對弓形蟲的凋亡進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),Amca1置于胞外緩沖液4 h時(shí)蟲體凋亡率為20%,顯著低于△ku80株(37%),而mca1-OE凋亡率為54%,證實(shí)MCA1參與調(diào)節(jié)弓形蟲凋亡。為了進(jìn)一步研究弓形蟲MCAs的功能,我們對MCA2 展開研究。對構(gòu)建的TgMCA2內(nèi)源性標(biāo)記蟲株進(jìn)行IFA,發(fā)現(xiàn)MCA2定位于弓形蟲胞質(zhì)中,未檢測到其向蟲體胞核轉(zhuǎn)移和與IMC1共定位的情況。利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了MCA2基因缺失株(△mca2)及MCA1和MCA2雙基因缺失株(△mca1△mca2)。對各基因調(diào)控蟲株比較研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的△mca2、△mca1與母源蟲株Aku80的分裂增殖無明顯差異,而雙基因缺失株△mca1Amca2的增殖能力顯著下降。經(jīng)腹腔感染的△ku80、△mca1和Amca2株速殖子的小鼠于感染后6至11天陸續(xù)死亡,各蟲株對小鼠的致病性差異不顯著,感染Amca1△mca2的37%小鼠(9/24)耐過并存活,說明雙基因缺失蟲株對小鼠的致病性降低。進(jìn)一步觀察細(xì)胞培養(yǎng)中各蟲株發(fā)育和繁殖,發(fā)現(xiàn)Amca1和△mca2單一基因缺失時(shí)不影響蟲體的內(nèi)二分裂,胞內(nèi)逸出的速殖子形態(tài)正常。雙基因缺失株Amca1Amca2的大部分速殖子(61.9%帶蟲空泡內(nèi)的速殖子)不能成功分裂出子代蟲體,出現(xiàn)多核體現(xiàn)象且子代蟲體的內(nèi)膜復(fù)合體表達(dá)和定位異常;釋放后的大部分蟲體在胞外環(huán)境變圓,不能保持正常形態(tài)。經(jīng)表面活性劑脫氧膽酸鹽提取全蟲蛋白,發(fā)現(xiàn)雙基因缺失蟲株△mca1 Amca2的內(nèi)膜復(fù)合體蛋白IMC1比Aku80蟲株更易溶解于脫氧膽酸鹽中,提示雙基因缺失株IMC1的成熟受到抑制,證實(shí)弓形蟲MCA1和MCA2共同參與蟲體IMC1的加工成熟。綜上所述,MCA1和MCA2在蟲體的生命活動中具有重要功能。MCA1參與弓形蟲自身凋亡,其在蟲體內(nèi)的定位隨著蟲體生命活動發(fā)生變化;兩種蛋白在蟲體分裂過程中共同發(fā)揮作用,參與弓形蟲二分裂過程中內(nèi)膜復(fù)合體蛋白IMC1的形成;而蟲體單一缺失MCA1或MCA2時(shí)對子代蟲體分裂的影響不顯著。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

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本文編號：1490106