本文關鍵詞： 多頭帶絳蟲 功能基因 克隆表達 蛋白特性分析 ELISA 酶學活性　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：多頭帶絳蟲呈世界性分布,成蟲寄生于犬、狼、狐貍等終末宿主的小腸,其中絳期幼蟲——腦多頭蚴寄生于牛、羊等偶蹄動物的腦和脊髓等處引起腦多頭蚴病(coenuriasis)。腦多頭蚴病呈世界性分布,常引起患病動物發(fā)生死亡,給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失,同時人也有感染的報道。本論文在前人研究基礎上,進一步對多頭帶絳蟲的密碼子偏好性使用進行了分析,并對GP50等四個多頭帶絳蟲功能基因進行了克隆、表達和蛋白特性研究,期待為腦多頭蚴病診斷抗原及基因工程疫苗的開發(fā)提供候選抗原。主要研究內(nèi)容與結果如下：1、多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組密碼子偏好性分析利用多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已注釋的8620個重構基因進行了同義密碼子偏好性使用分析。結果發(fā)現(xiàn)多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組密碼子整體呈弱偏好性,平均GC含量為49.29%,平均GC3含量為51.43%;核酸組成、突變壓力、自然選擇、基因表達水平、基因所編碼蛋白的總親水性平均系數(shù)、芳香性及氨基酸的選擇等均是影響多頭帶絳蟲密碼子偏好性使用的因素,其中自然選擇可能是影響多頭帶絳蟲密碼子偏好使用的最主要因素；多頭帶絳蟲核糖體基因密碼子的偏好使用主要受到突變的影響,而必需基因密碼子的偏好使用則主要受到選擇的影響；22個密碼子被確定為最優(yōu)密碼子,推測基因在進化過程中受到正選擇的影響；最優(yōu)密碼子整體上富含GC堿基(GC:AU=43：23),除CGU外的所有最優(yōu)密碼子都以G／C結尾。此外,研究發(fā)現(xiàn)多頭帶絳蟲與大腸桿菌、酵母和人均存在不同程度的密碼子偏好性差異,而與豆狀帶絳蟲的密碼子偏好性差異較小。本研究對多頭帶絳蟲密碼子偏好性使用模式進行了系統(tǒng)分析,這能夠為多頭帶絳蟲新基因的發(fā)現(xiàn)、開展多頭帶絳蟲分子遺傳工程和進化研究提供有價值的線索。2、多頭帶絳蟲GP50基因的克隆表達、組織分布及重組抗原間接ELISA診斷方法的建立從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出GP50基因,結果顯示GP50基因ORF框為897bp,其N-端有48bp的信號肽序列,除去信號肽后編碼282個氨基酸,預測的蛋白分子大小為31.02 kDa。免疫熒光顯示GP50蛋白主要分布于多頭帶絳蟲成蟲和腦多頭蚴的體表微毛區(qū)及體內(nèi)實質(zhì)區(qū),同時廣泛分布于多頭蚴包囊囊壁；以GP50重組表達蛋白為抗原建立了檢測山羊腦多頭蚴病的間接ELISA診斷方法,其敏感性為95%(19/20)、特異性為92.6%(25/27),與山羊細頸囊尾蚴血清和綿羊細粒棘球蚴血清存在交叉反應。人工感染多頭帶絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在感染后的整個檢測期(2-17周)GP50抗體值均呈現(xiàn)陽性。本研究提示GP50蛋白具有作為山羊腦多頭蚴病診斷抗原的潛在價值。3、多頭帶絳蟲酸性核糖體磷蛋白P2基因的克隆表達、組織分布及重組抗原間接ELISA診斷方法的建立從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出酸性核糖體磷蛋白P2基因(TmP2)。結果顯示TmP2基因ORF框為366bp,編碼121個氨基酸,預測其蛋白分子大小為13.42kDa,與豬帶絳蟲酸性核糖體磷蛋白P2基因的序列相似性為94%；免疫熒光顯示TmP2蛋白大量分布于多頭帶絳蟲成蟲和腦多頭蚴的實質(zhì)層,同時廣泛分布于腦多頭蚴包囊囊壁；以TmP2重組表達蛋白為抗原建立了檢測山羊腦多頭蚴病的間接ELISA診斷方法,其敏感性達95.0%(19/20)、特異性達96.3%(26/27),與山羊細頸囊尾蚴陽性血清存在交叉反應；人工感染多頭帶絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在感染后的3-10、15-17周呈現(xiàn)血清抗體陽性。本研究提示TmP2蛋白具有作為診斷抗原的潛在價值。4、多頭帶絳蟲脫氧尿苷焦磷酸酶基因的克隆、.表達及其重組蛋白的酶學活性分析從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因。結果顯示多頭帶絳蟲dUTPase基因ORF框為447 bp,編碼148個氨基酸,預測的蛋白分子大小為16.39 kDa,與豬囊尾蚴、豆狀囊尾蚴dUTPase基因氨基酸序列相似性分別為100%和96%。SDS-PAGE分析顯示與目的蛋白大小相符的特異條帶,純化后dUTPase蛋白的含量為0.907mg/mL。免疫熒光組化染色顯示dUTPase蛋白主要分布于多頭帶絳蟲成蟲的體內(nèi)實質(zhì)區(qū),體表微毛區(qū)有少量分布,同時廣泛分布于多頭蚴頭節(jié)和包囊囊壁外層。酶學活性試驗證實重組dUTPase能特異性降解dUTP,酶的比活力為986.29U.mg-1, EDTA能夠抑制dUTPase的活性,而Mg2+能夠增強腦多頭蚴dUTPase的活性。本研究對多頭帶絳蟲dUTPase基因的相關特性進行了初步的研究,為進一步研究多頭帶絳蟲dUTPase基因的生物學功能奠定了基礎。5、多頭帶絳蟲銅、鋅超氧化物歧化酶基因的克隆、表達及酶學活性分析從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因。結果顯示多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD基因ORF框為459bp,編碼152個氨基酸,預測的蛋白分子大小為16.72 kDa,其氨基酸序列與豬帶絳蟲和肥頭絳蟲Cu/Zn-SOD基因的相似性分別為98%和92%。純化后的多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD蛋白濃度為1.587mg/mL,羥胺法測得酶的比活力為3138±25.67 IU/mg prot。進一步研究證實H2O2、 SDS和EDTA對多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD酶活性有較強的抑制作用,而氯仿-乙醇和脲素則對多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD酶活性無影響。本研究對多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD基因的相關特性進行了初步的研究,為進一步研究多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD基因的生物學功能奠定了基礎。
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【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.734

【參考文獻】

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本文編號：1470705