本文關(guān)鍵詞： 柑橘全爪螨 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 解毒代謝 表達(dá)模式 抗性機(jī)理　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：柑橘全爪螨(Panonychus citri(Mc Gregor))是一種世界性分布的多食性害螨,可取食包括草本和木本在內(nèi)的106種寄主植物,但主要危害柑橘類果樹。目前對于柑橘全爪螨的防治仍然以化學(xué)藥劑為主。然而,由于該螨發(fā)育歷期短、世代重疊、繁殖力強(qiáng)等自身特點(diǎn),加之田間殺螨劑的不科學(xué)使用等客觀因素,導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生并迅速發(fā)展。針對柑橘全爪螨田間抗性水平監(jiān)測及抗性機(jī)理的研究將有助于為有效防控策略的制訂提供重要的理論指導(dǎo)。目前對介導(dǎo)昆蟲(螨)抗藥性的機(jī)理研究主要圍繞靶標(biāo)抗性以及代謝抗性兩個方面。其中,谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,GSTs;EC 2.5.1.18)作為生物體內(nèi)重要的解毒代謝酶之一,在生物體對內(nèi)源或外源物質(zhì)的解毒代謝過程中具有重要作用,而且,GSTs還參與抗氧化脅迫保護(hù)。已有研究報(bào)道證實(shí),GSTs參與昆蟲(螨)對殺蟲(螨)劑的解毒代謝,進(jìn)而介導(dǎo)昆蟲(螨)抗性的發(fā)生及發(fā)展。迄今,關(guān)于柑橘全爪螨GSTs的研究相對滯后,對柑橘全爪螨GSTs的功能研究及其介導(dǎo)的抗性機(jī)理更是鮮有報(bào)道。據(jù)此,為全面闡釋柑橘全爪螨GSTs介導(dǎo)代謝抗性的分子機(jī)理,本學(xué)位論文在對柑橘全爪螨重慶地區(qū)田間種群抗性水平監(jiān)測獲得相關(guān)殺螨劑抗性種群的的基礎(chǔ)上,通過分析轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),克隆獲得柑橘全爪螨GSTs基因的c DNA全長序列,系統(tǒng)分析這些基因的分子生物學(xué)信息;利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得柑橘全爪螨GSTs的重組蛋白并比較分析其酶學(xué)特性;采用高效液相色譜(high performance liquid chromatograph,HPLC)技術(shù)檢測并分析GSTs與殺螨劑之間的相互作用關(guān)系;應(yīng)用RT-q PCR(real time quqntitative-PCR)技術(shù)解析GSTs基因在柑橘全爪螨不同發(fā)育階段、藥劑脅迫以及不良環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式,預(yù)測潛在的生理功能;研究并建立柑橘全爪螨RNAi體系,解析柑橘全爪螨GSTs對殺螨劑的解毒代謝功能;最后,利用高通量測序技術(shù)篩選鑒定柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性相關(guān)基因,探討甲氰菊酯在柑橘全爪螨體內(nèi)的代謝途徑。本研究旨在全面解析柑橘全爪螨GSTs的解毒代謝功能及其介導(dǎo)的抗藥性機(jī)理,為柑橘全爪螨田間抗藥性的治理提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。本學(xué)位論文的主要研究結(jié)果總結(jié)如下:1.柑橘全爪螨田間種群的抗藥性監(jiān)測采用葉片浸漬法于2014年對柑橘全爪螨重慶地區(qū)4個種群(萬州、奉節(jié)、武隆和北碚)對常用殺螨劑的抗藥性水平進(jìn)行監(jiān)測。結(jié)果顯示,4個種群對甲氰菊酯均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。其中,甲氰菊酯對奉節(jié)種群和北碚種群的LC50值相對較高,分別為7.14 mg/L和5.30 mg/L,相對抗性水平達(dá)310和230倍;對萬州種群的LC50相對較低(1.23 mg/L),相對抗性倍數(shù)為53倍;而對武隆種群的LC50值與敏感種群相近,相對抗性倍數(shù)僅為4倍。阿維菌素對柑橘全爪螨萬州種群的LC50值較高,相對抗性倍數(shù)達(dá)14倍;噠螨靈對柑橘全爪螨奉節(jié)種群的相對抗性為12倍。柑橘全爪螨4個種群對新型殺螨劑丁氟螨酯較為敏感且均未產(chǎn)生抗藥性。2.柑橘全爪螨GSTs基因的克隆及序列分析在分析篩選轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)技術(shù)克隆獲得柑橘全爪螨10個GSTs基因的c DNA全長序列,通過序列同源比對將這10個GSTs基因分別歸類為delta(3)、mu(5)、omega(1)和zeta(1)4個家族。分子生物學(xué)信息分析結(jié)果顯示,10個GSTs基因的c DNA全長序列介于822-1289 bp之間,開放閱讀框長度范圍為645-735 bp,推導(dǎo)的氨基酸序列長度介于217-244個氨基酸殘基,所編碼蛋白的相對分子量大小范圍為23.9-27.7k Da,理論等電點(diǎn)范圍為5.18-7.65。序列多重比對結(jié)果顯示,10個GSTs基因的核苷酸序列同源性范圍在33.1-66.4%之間,氨基酸序列同源性范圍在10.9-60.8%之間。選取蜱螨亞綱二斑葉螨(Tetranychus urticae)32個GSTs基因和肩突硬蜱(Ixodes scapularis)16個GSTs基因以及昆蟲綱家蠶(Bombyx mori)20個GSTs基因作為參考,對柑橘全爪螨10個GSTs基因推導(dǎo)的氨基酸序列采用最大似然法通過MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,柑橘全爪螨10個GSTs與二斑葉螨GSTs的同源性最高,分別與其相應(yīng)的4個家族(delta、mu、omega和zeta)的GSTs聚在一起。結(jié)合二斑葉螨GSTs基因推導(dǎo)的氨基酸序列的多重比對分析,預(yù)測柑橘全爪螨4個家族GSTs的的催化活性位點(diǎn)分別位于Ser11(delta家族)、Tyr33(mu家族)、Cys32(omega家族)和Ser14(zeta家族)。柑橘全爪螨10個GSTs基因序列經(jīng)分析驗(yàn)證后登錄至Gen Bank,基因名稱及相應(yīng)的登錄號分別為:Pc GSTm1(JQ069034)、Pc GSTm2(JQ069035)、Pc GSTm3(JX846609)、Pc GSTm4(JX846610)、Pc GSTm5(KT717379)、Pc GSTd1(JQ069033)、Pc GSTd2(JQ069037)、Pc GSTd3(KU904396)、Pc GSTz1(JQ069036)和Pc GSTo1(KU904397)。3.柑橘全爪螨GSTs基因的原核表達(dá)及酶學(xué)特性分析采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),誘導(dǎo)并純化獲得柑橘全爪螨10個GSTs基因的重組蛋白,SDS-PAGE及Western blot技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果顯示重組蛋白的質(zhì)量較高。以CDNB(1-chloro-2,4 dinitrobenzene)為底物,對10個GSTs重組蛋白的催化活性進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,10個GSTs均具有催化CDNB與GSH(glutathione)反應(yīng)的活性,但活性高低存在差異。其中,Pc GSTm5和Pc GSTd1的催化活性顯著高于其余8個GSTs。熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示柑橘全爪螨重組GSTs在不高于50℃的條件下均能保持較高的活性,說明重組蛋白的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。最適p H測定結(jié)果顯示柑橘全爪螨10個GSTs均在p H7.5條件下催化活性最高,表明重組蛋白最適酶促反應(yīng)環(huán)境均為中偏堿性。對重組蛋白的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定,結(jié)果表明Pc GSTm3與CDNB的親和能力最強(qiáng)。以過氧化氫異丙苯為底物進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示柑橘全爪螨10個GSTs重組蛋白有一定的過氧化物酶活性。對重組蛋白離體抑制作用測定結(jié)果顯示,與特異性抑制劑利尿酸相比較,阿維菌素和甲氰菊酯均不能有效抑制柑橘全爪螨10個GSTs的催化活性。4.柑橘全爪螨GSTs基因的表達(dá)模式分析采用RT-q PCR技術(shù),解析柑橘全爪螨10個GSTs基因在不同發(fā)育階段、殺螨劑脅迫以及極端高溫脅迫后的表達(dá)模式。4.1.柑橘全爪螨GSTs基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式分析柑橘全爪螨10個GSTs基因在4個發(fā)育階段(卵、幼螨、若螨和成螨)均有所表達(dá),但表達(dá)水平存在差異。其中,Pc GSTm5和Pc GSTo1在幼螨、若螨和成螨期的表達(dá)水平顯著高于卵期。然而,Pc GSTm2、Pc GSTm3和Pc GSTd3在4個發(fā)育階段的表達(dá)量無顯著性差異變化。GSTs基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性暗示其功能可能具有多樣性。4.2.柑橘全爪螨GSTs基因應(yīng)對殺螨劑脅迫的表達(dá)模式分析經(jīng)不同殺螨劑亞致死濃度脅迫處理后,柑橘全爪螨10個GSTs基因的應(yīng)激表達(dá)模式存在差異。其中,阿維菌素能夠誘導(dǎo)Pc GSTm3、Pc GSTm4、Pc GSTm5和Pc GSTd1的m RNA水平顯著上調(diào),尤其Pc GSTm5的上調(diào)幅度最高。擬除蟲菊酯類殺螨劑甲氰菊酯脅迫處理后,Pc GSTm2、Pc GSTm3和Pc GSTd1的表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度上調(diào)。然而,柑橘全爪螨GSTs基因?qū)�粒體傳遞鏈抑制劑噠螨靈的脅迫響應(yīng)相對較弱,10個GSTs基因的m RNA表達(dá)水平與對照相比均無顯著性差異。此外,經(jīng)寄主植物次生代謝物檸檬醛脅迫處理后,柑橘全爪螨GSTs基因積極響應(yīng),在脅迫處理后12 h,Pc GSTm1、Pc GSTm3、Pc GSTm4和Pc GSTd1的相對表達(dá)量均顯著上調(diào)。綜合分析,經(jīng)阿維菌素、甲氰菊酯和檸檬醛脅迫處理后表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)的GSTs基因有可能參與對相應(yīng)藥劑的解毒代謝過程。4.3.柑橘全爪螨GSTs基因應(yīng)對高溫脅迫的表達(dá)模式分析柑橘全爪螨在41℃高溫條件下脅迫處理3 h,其體內(nèi)多數(shù)GSTs基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),其中,Pc GSTd1的表達(dá)水平上調(diào)幅度最為明顯,達(dá)對照的30倍。暗示GSTs可能通過其抗氧化功能,避免柑橘全爪螨受到由極端溫度引起的氧化脅迫傷害。5.柑橘全爪螨GSTs基因的解毒代謝功能分析5.1.柑橘全爪螨GSTs基因Pc GSTm5對阿維菌素的解毒代謝功能分析采用RT-q PCR技術(shù),分析柑橘全爪螨阿維菌素抗性及敏感品系GSTs基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,Pc GSTm5在抗性種群表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步采用RNAi技術(shù)干擾Pc GSTm5的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Pc GSTm5有效沉默后(沉默效率65%)柑橘全爪螨對阿維菌素的敏感性顯著升高,RNAi處理與對照的死亡率分別為55.6%和23.0%,表明Pc GSTm5可能參與柑橘全爪螨對阿維菌素的解毒代謝。但是,采用HPLC進(jìn)行藥劑離體代謝作用分析,結(jié)果顯示尚無證據(jù)表明Pc GSTm5能夠直接代謝阿維菌素。綜合分析,Pc GSTm5可能參與阿維菌素的解毒代謝,進(jìn)而介導(dǎo)柑橘全爪螨對阿維菌素的抗藥性。5.2.柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性與敏感品系比較轉(zhuǎn)錄組分析借助高通量測序技術(shù),對柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性和敏感品系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并在此基礎(chǔ)上通過比較轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)抗性和敏感品系間差異表達(dá)的基因861個,其中,499個基因在抗性種群表達(dá)上調(diào),362個基因在抗性種群表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步注釋499個上調(diào)表達(dá)基因的功能,發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因包括解毒代謝酶(P450s、GSTs、Car Es)、熱激蛋白、表皮蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及抗氧化酶基因等,且熱激蛋白、表皮蛋白以及抗氧化酶基因的上調(diào)倍數(shù)相對較高。推測上述基因可能共同參與甲氰菊酯的解毒代謝,據(jù)此提出了甲氰菊酯在柑橘全爪螨體內(nèi)的解毒代謝途徑。5.3.柑橘全爪螨GSTs基因Pc GSTd1對甲氰菊酯的解毒代謝功能解析采用RT-q PCR技術(shù),分析柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性及敏感品系GSTs基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,除Pc GSTm1、Pc GSTd3和Pc GSTo1以外,其余7個GSTs基因均在甲氰菊酯抗性種群過量表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果同樣顯示,Pc GSTd1在甲氰菊酯抗性種群過量表達(dá)。但是采用HPLC進(jìn)行藥劑離體代謝作用分析,結(jié)果顯示尚無充分證據(jù)表明Pc GSTd1能夠直接催化代謝甲氰菊酯。采用RNAi技術(shù)有效沉默該基因的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)Pc GSTd1可能參與調(diào)節(jié)柑橘全爪螨體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平,保護(hù)柑橘全爪螨免受由甲氰菊酯引起的氧化脅迫傷害。據(jù)此推測,Pc GSTd1可能是柑橘全爪螨對抗甲氰菊酯的充分但非必要因素。綜上所述,本學(xué)位論文研究在柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組分析篩選的基礎(chǔ)上,通過RACE技術(shù)克隆獲得了10個柑橘全爪螨GSTs基因的c DNA全長序列,詳盡分析了序列的分子生物學(xué)信息;利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了這些GSTs基因的重組蛋白,并比較分析了酶學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)Pc GSTm5和Pc GSTd1的重組蛋白具有相對較高的催化活性,暗示其在柑橘全爪螨GSTs超基因家族中可能占據(jù)重要地位;通過RT-q PCR技術(shù),解析了柑橘全爪螨GSTs基因在不同發(fā)育階段、藥劑脅迫以及極端溫度脅迫條件下的表達(dá)模式,推測相關(guān)上調(diào)GSTs基因可能參與阿維菌素、甲氰菊酯以及檸檬醛的解毒代謝過程;成功建立了柑橘全爪螨RNAi體系,在此基礎(chǔ)上證明Pc GSTm5可能參與柑橘全爪螨對阿維菌素的解毒代謝,進(jìn)而介導(dǎo)柑橘全爪螨對阿維菌素的抗藥性;RT-q PCR以及轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果均表明,Pc GSTd1的過量表達(dá)可能與柑橘全爪螨對甲氰菊酯的抗藥性相關(guān);此外,通過比較轉(zhuǎn)錄組分析篩選出甲氰菊酯抗性相關(guān)基因,探討并提出包括具有抗氧化功能的Pc GSTd1在內(nèi)的甲氰菊酯在柑橘全爪螨體內(nèi)的解毒代謝途徑。本研究首次從分子生物學(xué)水平對柑橘全爪螨GSTs基因的序列信息、酶學(xué)特性、表達(dá)模式及其解毒代謝功能進(jìn)行了較為全面深入地解析。所獲得的研究結(jié)果及結(jié)論,將為柑橘全爪螨田間抗藥性的治理以及新型有效防控策略的設(shè)計(jì)提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.66
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本文編號：1454366