本文關(guān)鍵詞： 角倍蚜 鹽膚木 角倍發(fā)育 植物激素 差異表達基因　出處：《中國林業(yè)科學(xué)研究院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鹽膚木是一種重要的經(jīng)濟樹種,在亞洲作為中藥利用已有很長的歷史。取食樹體汁液為生的的角倍蚜(Schlechtendalia chinensis)在其主要寄主植物鹽膚木(Rhus chinensis Mill)上引起葉片增生形成角倍。角倍的主要成分為五倍子單寧,以其為原料生產(chǎn)的單寧酸和沒食子酸等,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、印染、石油勘探、稀有金屬提取、食品工程等。角倍是在逐漸增多的角倍蚜群體操控下,刺激植物組織形成的蟲癭,是一個非常復(fù)雜并且被精確調(diào)控的生理過程,然而角倍發(fā)育的機制目前還不清楚。植物內(nèi)源激素在信號級聯(lián)反應(yīng)體系當(dāng)中充當(dāng)了關(guān)鍵角色,前人對內(nèi)源激素調(diào)控蟲癭發(fā)育的研究大多以表觀測定為主。因此,本研究以角倍為研究對象,以內(nèi)源激素在角倍形成發(fā)育過程中的時空變化為切入點,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)字基因表達譜、基因全長克隆和基因表達分析等不同手段,揭示了角倍形成過程中的樹體響應(yīng)及角倍形成分子機制,以期挖掘潛在的激素調(diào)控或基因操作手段來控制角倍發(fā)育。主要研究結(jié)果如下:(1)角倍形成過程中的內(nèi)源激素含量變化規(guī)律對角倍不同發(fā)育時期和不同組織的內(nèi)源激素濃度測定分析表明,生長素(IAA)、赤霉素(GA)、細胞分裂素(CTK)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)和乙烯(ET)七種內(nèi)源激素濃度在不同發(fā)育時期、不同組織以及兩者之間的互作效應(yīng)都存在顯著差異。其中,在第2時期(85d),角倍的IAA、CTK、JA、SA、ABA和ETH濃度顯著增高;在第5時期(125d),角倍的CTK、ABA、JA和ETH含量顯著增高;在發(fā)育末期(170d),IAA、CTK、SA和ETH含量顯著增高,這表明角倍不同階段的發(fā)育都涉及到生長促進類激素和防御類激素的共同調(diào)控,另外樹體受到角倍蚜攻擊后產(chǎn)生了明顯的激素響應(yīng)�？傮w上,致癭樹上所有樣本(角倍、有倍葉和無倍葉)的激素濃度(除GA外)都比未致癭的樹體對照葉片高。有意思的是IAA、CTK、ABA、JA、SA和ETH在整個角倍發(fā)育過程都表現(xiàn)出相似的變化趨勢,只有GA的趨勢相反,表明GA可能在控制角倍生長過程中發(fā)揮獨特作用。(2)內(nèi)源激素濃度變化與角倍生長的關(guān)系角倍體積與角倍蚜種群數(shù)量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān),角倍蚜種群數(shù)量與角倍GA濃度呈極顯著正相關(guān),而與CTK,ABA和ETH濃度呈負相關(guān)。對所有激素進行主成分分析,發(fā)現(xiàn)GA獨立聚為一組。GA與角倍體積達到極顯著正相關(guān),表明GA是促進角倍生長的關(guān)鍵調(diào)控激素。為了闡明環(huán)境變化對所有組織樣本激素含量的影響,把三個蟲癭樹樣本(Gall、GL、和LW)除以非蟲癭樹的對照葉片(CL)進行標準化。標準化后的數(shù)據(jù)表明當(dāng)樹體受到蚜蟲攻擊后,三個蟲癭樹樣本的GA整體水平都呈現(xiàn)降低,其中角倍GA降低的幅度最小。進一步的外源激素施用結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比,IAA和CTK對角倍生長沒有明顯的促進作用。從30到85d,ABA顯著的促進了角倍發(fā)育,但在發(fā)育后期,ABA處理的角倍生長緩慢,最終的角倍體積小于其他處理。施用ABA抑制劑—鎢酸鈉造成葉片枯萎和苗木死亡,表明ABA所起的作用很復(fù)雜,發(fā)育前期促進角倍生長,后期抑制生長。而與其他處理相比,GA對角倍生長有更顯著的促進作用。因此我們提出一個模型:寄主植物通過下調(diào)內(nèi)源GA濃度達到抑制角倍生長的目的,但是致癭蚜蟲種群又通過不同方式拮抗寄主植物的這一行為,從而促進角倍生長。(3)角倍形成相關(guān)差異表達基因的挖掘采用Illumina技術(shù)對四種組織材料進行深度測序,總計獲得59522條Unigene。差異基因顯著富集在次生代謝、植物病原菌互作和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)三條通路上。通過系統(tǒng)聚類發(fā)現(xiàn),與葉片材料相比,上述三條代謝通路當(dāng)中的基因多數(shù)在角倍樣本中高表達。對激素相關(guān)基因表達量的主成分分析結(jié)果顯示IAA和ABA在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中占主導(dǎo)位置。進一步通過熒光定量PCR驗證了部分轉(zhuǎn)錄本的表達,包括參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生長素響應(yīng)因子(ARF)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(SPKB)、生長素響應(yīng)蛋白(ARP)、雙組分響應(yīng)調(diào)節(jié)子ARR12(TCRR)、F-box蛋白GID2(FPG)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(SPK)、蛋白磷酸酶2C(PP2C)、乙烯不敏感蛋白(EIP)、乙烯受體(ER)、油菜素類固醇不敏感型受體激酶前體(BIRK)、DELLA蛋白GID2(DPGI)和LMYC2,參與次生代謝的氨基苯甲酸鹽合成酶(ASAS)、葉綠體生物素羧酶(CBC)、細胞色素P450(CP),參與植物病原菌互作的病原相關(guān)蛋白1a(PP1A)和PRUPE蛋白(PPA),參與蔗糖代謝的糖基轉(zhuǎn)移酶(G8E)、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(SAI)和纖維素合成酶(CSCS)。這些轉(zhuǎn)錄本的表達模式分三種類型:下降型(ARF、ASAS和SPKB)、雙峰型(ARP、TCRR、FPG、PPIA、BIRK、CBC、PPA、G8E和CP)和峰谷型(SPK、PP2C、EIP、ER、SAI、CSCS、DPGI和LMYC2)。以上角倍初生和次生代謝相關(guān)基因可能受激素相關(guān)基因的調(diào)控。(4)GA和ABA相關(guān)基因的克隆及對角倍發(fā)育的影響激素濃度和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達量的主成分分析結(jié)果并不能完全重疊。有意思的是,ABA在二者的PCA結(jié)果中都占有較高的權(quán)重。進一步鑒定到22個與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本,其中19個被注釋作為蛋白磷酸酶2C(PP2C),大部分轉(zhuǎn)錄本在角倍中比葉片具有更高的表達。因此選擇了蛋白磷酸酶2C和與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的GAI基因進行克隆分析,分離得到一個長度為1013bp的RcPP2C和977bp的RcGAI全長基因�；虮磉_分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因在角倍和葉片材料中都屬于組成型表達;從角倍發(fā)育初期至末期,RcPP2C基因的表達量呈現(xiàn)波動變化,而RcGAI基因的表達量呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢;結(jié)合外源實驗表明ABA在角倍發(fā)育中的防御響應(yīng)和水分調(diào)控中發(fā)揮了作用,且存在劑量效應(yīng),RcPP2C基因負向調(diào)控ABA反應(yīng);RcGAI的表達量與GA含量呈負相關(guān),與角倍體積呈顯著的負相關(guān)。綜上所述,本研究分析了GA受到角倍蚜和樹體雙重影響后整體下調(diào)的規(guī)律,揭示了GA促進角倍形成和發(fā)育的獨特作用。另外用深度測序構(gòu)建了角倍發(fā)育的轉(zhuǎn)錄本,發(fā)現(xiàn)次生代謝、植物病原菌互作和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)三條代謝通路顯著富集。進一步篩選到與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的Rc GAI基因、以及與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的RcPP2C基因,并進行全長克隆,最終通過基因表達分析耦合外源激素施用結(jié)果表明:RcGAI和RcPP2C基因分別負向調(diào)控GA和ABA反應(yīng)從而影響角倍的發(fā)育。
[Abstract]:Rhus chinensis is an important economic species, has a long history of using Chinese medicine in Asia. As the feeding tree sap of SCHLECHTENDALIA chinensis (Schlechtendalia chinensis) in the main host plant (Rhus chinensis Mill) on Rhus chinensis Leaves caused by hyperplasia of the angle formed times. Main components of SCHLECHTENDALIA gallnut tannin. Its production of raw materials such as tannic acid and gallic acid, widely used in pharmaceutical, printing and dyeing, petroleum exploration, extraction of rare metal, food engineering. SCHLECHTENDALIA SCHLECHTENDALIA chinensis is in control group increased gradually under the stimulation of plant tissue formed galls, is a very complicated and precise regulation of physiological processes, however SCHLECHTENDALIA development mechanism is not clear. Plant hormones play a crucial role in the signaling cascade system, studies on the regulation of endogenous hormones and development of galls mostly apparent determination to The Lord. Therefore, based on the angle of times as the research object, the endogenous hormones in SCHLECHTENDALIA change during development as the starting point, combining transcriptome sequencing, digital gene expression, gene cloning and gene expression analysis of different methods, reveals the formation process of SCHLECHTENDALIA tree and response angle times the molecular mechanism of the formation, in order to excavate the operation means hormone regulation or gene potential to control the angle of times development. The main results are as follows: (1) the angle of endogenous hormone concentration during times of the diagonal changes of Endogenous Phytohormones in times of different developmental stages and different tissues analysis shows that auxin (IAA). Gibberellin (GA), cytokinin (CTK), abscisic acid (ABA), jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA) and ethylene (ET) seven kinds of endogenous hormone concentrations in different developmental stages, the interaction effect between different organizations and both are significantly different. 鍏朵腑,鍦ㄧ2鏃舵湡(85d),瑙掑，

本文編號：1444713