本文關(guān)鍵詞： 弓形蟲 急性感染 抗原蛋白譜 蛋白表達(dá) 診斷 基因敲除　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：弓形蟲是一種世界范圍內(nèi)寄生的原蟲,可導(dǎo)致人畜流產(chǎn)、死胎和免疫抑制患者死亡,臨床表現(xiàn)復(fù)雜,確診困難,缺少有效的治療藥物,給公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)帶來極大危害。弓形蟲循環(huán)抗原(Circulating Antigens,CAg)是急性感染期蟲體自身排泄和裂解產(chǎn)物,CAg陽性提示弓形蟲病急性、活動性感染,是早期感染的可靠指標(biāo)。排泄-分泌抗原(Excretory / Secretory Antigens,ESA)是CAg的主要成分。尋找弓形蟲早期感染相關(guān)的蛋白,深入了解弓形蟲的致病機(jī)理和發(fā)現(xiàn)新型診斷候選分子是當(dāng)前動物弓形蟲病研究亟待解決的問題。蛋白質(zhì)組學(xué)在尋找診斷標(biāo)記、藥物靶標(biāo)和弓形蟲毒力因子方面具有廣泛優(yōu)勢,因此可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)全面了解弓形蟲急性感染動物血清中循環(huán)抗原的組成。本研究了建立弓形蟲急性感染犬模型,利用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定宿主血清中與弓形蟲急性感染相關(guān)的標(biāo)志蛋白及毒力因子,并選取與弓形蟲致病機(jī)理有關(guān)的新鑒定的循環(huán)抗原進(jìn)行功能與應(yīng)用研究,旨在發(fā)現(xiàn)新的診斷候選蛋白和毒力因子并進(jìn)一步闡述弓形蟲急性感染的的致病機(jī)理。試驗一:免疫沉淀-shotgun以及免疫二維電泳鑒定弓形蟲急性感染血清中的標(biāo)記蛋白在本試驗中,首先制備ESA及其鼠源多克隆抗體,通過將健康比格犬腹腔內(nèi)注射1X109純化速殖子建立急性感染模型,感染后每天監(jiān)測體溫并采血,提取血液DNA進(jìn)行套式PCR檢測弓形蟲,同時采集血液監(jiān)測血細(xì)胞、生化指標(biāo)以及弓形蟲循環(huán)抗原及其抗體水平;弓形蟲急性感染犬模型感染后2-3 d的血清以蛋白酶抑制劑處理,利用Protein A去除犬血清IgG后,以免疫沉淀技術(shù)富集弓形蟲急性感染犬血清中的CAg,將富集成分進(jìn)行膜輔助蛋白質(zhì)組樣品制備,酶解后用于LC-MS/MS檢測;另外,ESA經(jīng)雙向電泳分離后,以弓形蟲急性感染犬第18d血清作為一抗進(jìn)行Western-blot分析,將Western-blot結(jié)果與經(jīng)考馬斯亮蘭或銀染色的2-DE凝膠對比,切取匹配的點用胰酶消化后進(jìn)行質(zhì)譜測定;將上述兩種方法得到原始文件用Mascot 2.2軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,同時將所鑒定的蛋白進(jìn)行基因本體注釋(GO)分析和蛋白質(zhì)相互作用分析。結(jié)果顯示弓形蟲急性感染24 h后,犬出現(xiàn)發(fā)熱癥狀,3d后體溫開始下降體溫,7d后趨于正常,感染犬的PLT在第5d顯著(P0.05)降低,血清ALT活力在4到12 d顯著升高(P0.05),AST活力在5到12 d時也比對照組顯著增高(P0.05),表明感染犬肝功能異常,血液弓形蟲套式PCR檢測陽性,感染后的血液中可檢測到弓形蟲CAg,感染后第18d CAg抗體達(dá)到峰值,上述結(jié)果表明弓形蟲急性感染模型成功建立;LC-MS/MS成功鑒定了 220個蛋白質(zhì),免疫二維電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜成功鑒定了8個蛋白質(zhì),3種蛋白同時被兩種方法鑒定(熱休克蛋白質(zhì)70、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和烯醇酶2); GO結(jié)果表明所鑒定的蛋白主要參與蛋白質(zhì)代謝、結(jié)合、氧化還原過程、糖代謝、應(yīng)激等生物學(xué)過程以及作為細(xì)胞外成分和膜成分;蛋白質(zhì)相互作用分析結(jié)果表明所鑒定的蛋白參與非同源末端連接、沙門氏菌感染、細(xì)菌性痢疾和粘著連接等病理過程的信號通路中。試驗二:部分鑒定蛋白的表達(dá)、純化及其作用機(jī)理研究根據(jù)GO分析結(jié)果及已發(fā)表的研究結(jié)果,在成功鑒定的225種蛋白中選取Coronin、ELMO、eEF2和RPL40進(jìn)行原核表達(dá)及功能鑒定,構(gòu)建pET-28a-c(+)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,誘導(dǎo)表達(dá)后收集蛋白并進(jìn)行復(fù)性及純化,去除內(nèi)毒素并檢測濃度后制備四種蛋白的鼠源多克隆抗體,利用Western blotting方法驗證急性感染血清中四種蛋白的存在,利用細(xì)胞免疫熒光對四種蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位,流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體對弓形蟲入侵細(xì)胞的阻斷作用,并利用致死試驗和絕對熒光定量評價免疫四種重組蛋白對弓形蟲(RH)感染小鼠的保護(hù)效果。結(jié)果表明,四種蛋白均存在于急性弓形蟲感染小鼠的血清中;間接免疫熒光表明,Coronin主要集中在速殖子的前部,少量分布在后端和表面,ELMO主要分布在速殖子的外周,eEF2集中在蟲體的一端,RPL40分散在胞質(zhì)中;Coronin,EMLO,eEF2和RPLA0的抗體降低了剛地弓形蟲體外入侵細(xì)胞的效率;免疫這四種蛋白延長了剛地弓形蟲感染小鼠的存活時間,對弓形蟲感染小鼠血液、肝臟、脾臟和腦組織中的蟲體數(shù)量表現(xiàn)不同程度的抑制效果。試驗三:重組弓形蟲Coronin和EMLO蛋白在診斷弓形蟲感染中的應(yīng)用為鑒定和評價新的弓形蟲診斷候選分子,對新發(fā)現(xiàn)的弓形蟲循環(huán)抗原進(jìn)行BLAST分析發(fā)現(xiàn),弓形蟲Coronin和ELMO蛋白與其他物種的同源性較低,為了檢測這兩種蛋白在弓形蟲病診斷方面的意義,本試驗對兩種蛋白進(jìn)行了進(jìn)化樹分析;建立以重組蛋白為包被抗原檢測血液中弓形蟲特異性IgG為基礎(chǔ)的ELISA診斷方法,通過與標(biāo)準(zhǔn)弓形蟲診斷試劑盒進(jìn)行比較來評價診斷的準(zhǔn)確性和一致性;此外,以該兩種重組蛋白的多克隆抗體可以檢測血液循環(huán)抗原為基礎(chǔ),建立弓形蟲急性感染的ELISA診斷方法,通過檢測本研究建立的弓形蟲急性感染模型的血清樣品并與與套式PCR結(jié)果對比來評價診斷效果。結(jié)果表明,兩種蛋白與其他物種的進(jìn)化樹分析差異較大;利用兩種重組蛋白建立的ELISA檢測方法診斷弓形蟲感染的一致性和特異性高,H值高于0.6,診斷結(jié)果可信;兩種蛋白在弓形蟲急性感染犬血清中的變化與循環(huán)抗原變化一致,隨著蟲體消失而逐漸清除,具有良好的診斷價值。試驗四:弓形蟲硫氧還蛋白還原酶的表達(dá)及其功能研究硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase, TR)是一種NADPH依賴的包含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶,和硫氧還蛋白及NADPH共同組成了一個有效的蛋白還原系統(tǒng),稱為硫氧還蛋白系統(tǒng),弓形蟲硫氧還蛋白還原酶不含硒代半胱氨酸,含有622個氨基酸殘基。本試驗對TR蛋白進(jìn)行全長和分兩段分別進(jìn)行大腸桿菌原核表達(dá),蛋白質(zhì)復(fù)性和純化后檢測重組硫氧還蛋白還原酶的活性,并將重組蛋白切除標(biāo)簽后進(jìn)行酶促反應(yīng)動力學(xué)檢測;制備鼠源多克隆抗體,利用免疫透射電鏡對弓形蟲TR蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位;利用CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)敲除弓形蟲TR基因,并構(gòu)建TR基因敲除的互補(bǔ)株,分別篩選單克隆蟲株,利用PCR、雙標(biāo)免疫熒光和免疫印跡驗證TR基因缺失與插入;檢測基因敲除弓形蟲的入侵細(xì)胞能力、增殖能力及抗氧化應(yīng)激能力;檢測TR基因敲除弓形蟲對宿主細(xì)胞因子的產(chǎn)生和致病力的影響。結(jié)果表明,全長包涵體表達(dá)的重組弓形蟲TR蛋白酶活力部分恢復(fù),含有1-380氨基酸殘基的片段和375-662氨基酸殘基的片段可溶性表達(dá)并具有高硫氧還蛋白還原酶活性,三種重組蛋白以NADPH和DTNB為底物的Km值分別為11.47-15.57和130.48-151.09;免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn),TR蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)中,其中蟲體前部分布較多;PCR、免疫熒光和免疫印跡結(jié)果表明TR基因缺失株和互補(bǔ)株構(gòu)建成功;TR基因敲除弓形蟲體外入侵Vero細(xì)胞的效率降低、增殖速度減慢、蟲體抗氧化能力降低;與野毒株相比,TR基因缺失對弓形蟲刺激宿主產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力無影響,TR基因敲除弓形蟲對小鼠的毒力降低,弓形蟲TR基因缺失所導(dǎo)致的毒力降低主要是由于蟲體抗氧化系統(tǒng)缺陷所致。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.292
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本文編號：1443139