本文關(guān)鍵詞：新疆非禽類(lèi)野生動(dòng)物流感抗體調(diào)查與流感病毒樣顆粒疫苗研究　出處：《石河子大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：A型流感病毒是真正人畜共患病原并具有高度傳染性。盡管A型流感病毒有著嚴(yán)格的宿主范圍,但是跨種傳播時(shí)有發(fā)生。近年來(lái)除了人可被禽流感H5N1、H9N2和H7N9病毒感染外,還有多種動(dòng)物被流感病毒感染的報(bào)道,并從貓、果子貍、老虎、獅子和紅狐中分離到H5N1禽流感病毒。野生鳥(niǎo)類(lèi)被看作是A流感病毒的主要攜帶者,隨著其長(zhǎng)距離跨境遷徙潛在傳播并擴(kuò)散病毒。新疆位于候鳥(niǎo)東非-西亞遷徙線(xiàn),境內(nèi)棲息著大量鳥(niǎo)類(lèi)和非禽類(lèi)野生動(dòng)物。由于野生動(dòng)物和這些遷徙的鳥(niǎo)類(lèi)共享?xiàng)⒌?野生動(dòng)物存在被流感病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。鑒于動(dòng)物流感的嚴(yán)重危害性及野生動(dòng)物攜帶流感病毒的潛在威脅性,本研究中利用血凝抑制試驗(yàn)(HI)和競(jìng)爭(zhēng)ELISA(c-ELISA)方法調(diào)查了新疆非禽類(lèi)野生動(dòng)物中流感H5、H7和H9亞型的暴露現(xiàn)狀,為野生動(dòng)物流感防控提供數(shù)據(jù)資料。A型流感病毒通過(guò)突變、重配和重組不斷地適應(yīng)著新宿主,疫苗是預(yù)防其暴發(fā)流行的有效手段。病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)可通過(guò)其結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝出芽形成病毒粒子,結(jié)構(gòu)模擬病毒自身但是不能自我復(fù)制,確保了安全性及免疫原性。同時(shí),因流感VLPs不依賴(lài)于雞胚而被視為流感疫苗候選者。目的:本研究以流感病毒為研究對(duì)象,調(diào)查新疆部分非禽類(lèi)野生動(dòng)物中禽流感血清學(xué)數(shù)據(jù),并利用家蠶及Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建流感VLPs研究其免疫原性,為流感儲(chǔ)備疫苗研究提供數(shù)據(jù)參考。(1)了解新疆非禽類(lèi)野生動(dòng)物禽流感暴露現(xiàn)狀;(2)探索以家蠶作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)流感VLPs;(3)探索Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備流感新型儲(chǔ)備疫苗;(4)評(píng)估流感嵌合病毒樣顆粒(cVLPs)免疫原性。方法:(1)采用HI及c-ELISA方法對(duì)2009年~2013年采集的246份野生動(dòng)物(盤(pán)羊、巖羊、鵝喉羚、牦牛、野豬、馬鹿、狼、北山羊及狍子)血清樣品進(jìn)行禽流感病毒H5、H7及H9亞型的血清學(xué)調(diào)查。(2)構(gòu)建家蠶重組桿狀病毒rBmNPV(HA-M1-NA),感染家蠶5齡幼蟲(chóng)及蠶蛹,經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)、電鏡觀察、小鼠免疫試驗(yàn)及攻毒保護(hù)評(píng)價(jià)家蠶桿狀病毒表達(dá)流感VLPs免疫原性。(3)利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組桿狀病毒AcMNPV(HA-M1-NA),感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf 9,經(jīng)western blotting及免疫熒光檢測(cè)目的蛋白表達(dá)、電鏡觀察流感VLPs、小鼠免疫后檢測(cè)T細(xì)胞增殖及測(cè)定細(xì)胞因子濃度,評(píng)價(jià)Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組流感VLPs免疫原性。(4)將纖毛蛋白基因fliC通過(guò)基因合成嵌合于流感病毒HA基因中構(gòu)建流感cVLPs,經(jīng)western blotting及免疫熒光檢測(cè)目的蛋白表達(dá)、電鏡觀察流感病毒樣顆粒、小鼠免疫后檢測(cè)IgG水平和測(cè)定細(xì)胞因子濃度及攻毒試驗(yàn),評(píng)價(jià)流感病cVLPs免疫原性。結(jié)果:(1)新疆部分非禽類(lèi)野生動(dòng)物禽流感血清學(xué)調(diào)查:HI檢測(cè)結(jié)果顯示4.47%血清樣品流感抗體陽(yáng)性;狼和盤(pán)羊血清樣品H7亞型抗體陽(yáng)性率分別為9.09%和4.55%;鵝喉羚、狼、巖羊和盤(pán)羊血清樣品H9亞型抗體陽(yáng)性率分別為2.27%,27.27%,23.08%和4.55%。c-ELISA結(jié)果顯示4.88%血清樣品流感抗體陽(yáng)性;鵝喉羚、狼、巖羊和盤(pán)羊血清陽(yáng)性率分別為6.82%,36.36%,23.08%和9.09%。馬鹿、野豬、北山羊、狍子和牦牛血清樣品中禽流感H5、H7及H9亞型抗體均為陰性。(2)家蠶及蠶蛹能正確表達(dá)并組裝具有血凝活性的流感病VLPs,獲得的流感VLPs免疫小鼠之后,可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體;攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明獲得的流感顆粒具有較強(qiáng)的免疫原性;肌注免疫途徑效果最佳。(3)利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建重組桿狀病毒AcMNPV(HA-M1-NA),感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf 9之后,細(xì)胞能夠正確表達(dá)流感病VLPs,該VLPs免疫小鼠能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化,血清中可檢測(cè)到高濃度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ細(xì)胞因子,表明Bac-to-Bac/IC系統(tǒng)表達(dá)的流感VLPs可誘導(dǎo)Th1和Th2型免疫反應(yīng)。(4)重組桿狀病毒AcMNPV-HA-fliC-NA-M1,感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf 9之后,細(xì)胞能夠表達(dá)并正確組裝流感cVLPs,該cVLPs免疫小鼠可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化;血清中可檢測(cè)到高濃度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ細(xì)胞因子;cVLP免疫小鼠血清中有較高水平IgG抗體,且IgG抗體亞型分布以IgG1和IgG2b為主;攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明獲得的流感cVLPs具有異源異型交叉保護(hù)性。結(jié)論:(1)一定比例新疆非禽類(lèi)野生動(dòng)物曾感染過(guò)禽流感病毒。鵝喉羚、狼、巖羊和盤(pán)羊血清樣品H9亞型抗體陽(yáng)性;狼和盤(pán)羊血清樣品H7亞型抗體陽(yáng)性;馬鹿、野豬、北山羊、狍子和牦牛血清樣品H5、H7及H9亞型抗體均為陰性。(2)家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)并組裝有血凝活性的流感VLPs;該VLPs免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體;攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明其具有較強(qiáng)的免疫原性;肌注免疫途徑效果最佳。(3)Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能表達(dá)并正確組裝出具有較強(qiáng)免疫原性的流感VLPs,該VLPs可誘導(dǎo)免疫小鼠機(jī)體產(chǎn)生Th1和Th2型免疫反應(yīng)。(4)成功制備流感cVLPs且具有較強(qiáng)的免疫原性,可誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞活化,血清中有高濃度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ細(xì)胞因子及IgG抗體。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明cVLPs具有異源交叉保護(hù)性。
[Abstract]:In this study , we investigated the status of influenza H5 , H7 and H9 subtype in non - avian wild animals in Xinjiang . The recombinant baculovirus AcMNPV ( HA - M1 - NA ) was constructed by the recombinant baculovirus AcMNPV ( HA - M1 - NA ) . The results showed that the positive rates of influenza virus - like particles were 2.27 % , 27.27 % , 23.08 % and 4.55 % respectively . Conclusion : ( 2 ) The recombinant baculovirus AcMNPV - HA - fliC - NA - M1 can induce the activation of T cells . The recombinant baculovirus AcMNPV - HA - fliC - NA - M1 can induce the activation of T cells . ( 3 ) The expression system can express and correctly assemble influenza VLPs with stronger immunogenicity , which can induce Th1 and Th2 immune responses in immune mouse body . ( 4 ) The preparation of influenza - cVLPs can induce the activation of T cells in mice , and the serum has high levels of IL - 2 , IL - 4 , IL - 10 and IFN - 緯 cytokines and IgG antibodies .

【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S858.9

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6 王，

本文編號(hào)：1440844