本文關(guān)鍵詞：綿羊附睪GPx5基因表達調(diào)控的分子機制　出處：《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：附睪是家畜生殖系統(tǒng)中的重要器官之一,負責(zé)精子的成熟、轉(zhuǎn)運和儲存。附睪功能的實現(xiàn)依賴于其旺盛的生理活性,因而自由基的產(chǎn)生是不可避免的。自由基過度積累或缺乏氧化酶勢必造成附睪氧化應(yīng)激,引起精子質(zhì)膜及其DNA發(fā)生氧化損傷,極大地影響精子運動和受精能力,從而造成公畜繁殖能力的下降。谷胱甘肽過氧化酶家族(GPx)的主要功能是維持公畜生殖道內(nèi)自由基正常水平,能夠有效保護精子。因此,本研究以綿羊為研究模型,探討GPx5基因在綿羊附睪上的時空表達特性及雄激素對綿羊附睪GPx5基因表達的影響,并在體外構(gòu)建綿羊附睪上皮細胞系,在細胞水平上對GPx5基因的表達模式進行研究。利用RNAi技術(shù),在轉(zhuǎn)錄水平上初步鑒定GPx5基因的抗氧化機制。本研究成果一方面可以從分子水平上詮釋GPx5時空特異性表達調(diào)控的機制,另一方面可以為組織特異表達基因的分子調(diào)控機制的研究提供新思路,同時可豐富家畜繁殖生理學(xué)的分子調(diào)控理論。經(jīng)上述試驗,得到如下研究結(jié)果：1.采用熒光定量PCR技術(shù)、免疫印跡技術(shù)及免疫熒光法檢測GPx5基因在不同發(fā)育期綿羊附睪不同部位上的mRNA和蛋白水平表達及分布定位。熒光定量PCR結(jié)果表明,8月齡羊附睪頭部GPx5基因mRNA表達量顯著高于體部和尾部(P0.05);同時其表達量顯著高于2月齡羊和5歲羊附睪頭部(P0.05)。經(jīng)RT-PCR鑒定,綿羊精子上表達GPx5基因。免疫印跡結(jié)果表明,2月齡羊附睪中未檢測到GPx5蛋白表達；在8月齡羊附睪不同部位均有表達,而5歲羊附睪頭部和體部表達,尾部無表達。進一步,灰度分析結(jié)果表明,8月齡羊附睪頭部GPx5表達量顯著高于其它部位(P0.05),且表達量也顯著高于5歲羊附睪頭部(P0.05)。免疫熒光結(jié)果表明,在2月齡羊附睪未檢測到GPx5蛋白表達信號；8月齡羊附睪不同部位均有熒光信號表達,且頭和體部熒光強度明顯高于附睪尾部,同時在附睪管液體中也發(fā)現(xiàn)有熒光信號；5歲羊附睪頭部和體部有熒光信號,且熒光信號遍布于附睪管假復(fù)層上皮細胞的細胞核和細胞質(zhì)中；附睪精子膜上檢測到熒光信號。GPx5基因mRNA在綿羊不同發(fā)育時期附睪中均有表達,但在附睪不同部位表達確有差異；GPx5蛋白在附睪管假復(fù)層上皮細胞內(nèi)表達,但2月齡羊和5歲羊附睪尾部不表達,由此推測,GPx5的蛋白表達與綿羊性機能發(fā)育有密切關(guān)聯(lián)。2.利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、實時熒光定量PCR和免疫印跡法,研究雄激素對綿羊附睪特異性表達基因GPx5的影響。ELISA結(jié)果表明,用丙酸睪酮處理公羊后其血清、附睪的二氫睪酮(DHT)、雄激素受體(AR)及附睪睪酮(T)含量均顯著提高(P0.05)；實時熒光定量PCR結(jié)果表明,丙酸睪酮處理組與對照組相比,GPx5mRNA表達量顯著提高(P0.05)；免疫印跡結(jié)果表明,處理組附睪GPx5蛋白表達量顯著高于對照組(P0.05)。由此推測,綿羊附睪特異性基因GPx5的表達受雄激素的調(diào)控。3.采用機械剪切結(jié)合酶消化法,成功建立了綿羊附睪上皮細胞系,體外生長時呈扁平不規(guī)則多角,細胞生長曲線呈“S”型。采用RT-PCR法和免疫熒光法,檢測附睪上皮細胞GPx5基因mRNA和GPx5、角蛋白(CK18)表達。免疫熒光結(jié)果顯示,細胞間緊密相連形成單層膜,呈現(xiàn)鵝卵石樣排列；上皮細胞中均檢測到CK18和GPx5蛋白的熒光信號。經(jīng)RT-PCR鑒定,綿羊附睪上皮細胞表達GPx5基因。4.采用RNA干擾和重組腺病毒技術(shù),沉默綿羊附睪上皮細胞GPx5基因表達,再用Ad5/F35MaxTM重組腺病毒系統(tǒng),將攜帶外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶腺病毒基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞,借助Cre/loxP系統(tǒng)的作用重組產(chǎn)生腺病毒。將設(shè)計好的寡聚GPx5 shRNA經(jīng)退火復(fù)性后插入穿梭質(zhì)粒pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP中。設(shè)計3組靶向GPx5基因shRNA干擾序列,并分別構(gòu)建3組GPx5 shRNA1、GPx5 shRNA2、GPx5　shRNA3腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染HEK293細胞,通過包裝、擴增后產(chǎn)生干擾重組腺病毒AD-GPx5 shRNA 1、AD-GPx5 shRNA2、AD-GPx5 shRNA3, TCID50法測定其滴度分別為1×1010PFU/ml、1.26x1010PFU/ml,1.58×1010PFU/ml。用AD-GPx5 shRNA感染上皮細胞(MOI=100),實時定量PCR檢測表明,在病毒感染24 h和36h,綿羊附睪上皮細胞中GPx5 mRNA表達量在AD-GPx5 shRNA1、AD-GPx5 shRNA2和AD-GPx5 shRNA3感染后分別顯著下調(diào)了42%、40%、44%和65%、75%、73%(P0.05),其中AD-GPx5 shRNA2和AD-GPx5 shRNA3的干擾效果最佳,檢測SOD活力,細胞GSH含量結(jié)果表明AD-GPx5 shRNA2組與AD-GFP組相比較顯著提高(P0.05)。因此在后續(xù)的試驗中可用AD-GPx5 shRNA2干擾載體,并且GPx5基因表達量減少引起其他氧化因子的增多。
[Abstract]:On one hand , the expression of GP5 mRNA and its expression in the head and tail of sheep were studied by means of fluorescence quantitative PCR , Western blotting and immunofluorescence . The results showed that GP5 gene expression was not detected in the head and body part of sheep ' s testis at different developmental stages . The expression of GPx 5 mRNA and GP5 mRNA in the epithelial cells of sheep were determined by RT - PCR and immunofluorescence assay . The results showed that the expression of GP5 mRNA in the epithelial cells of sheep was significantly higher than that of control group ( P0.05 ) . The results showed that AD - GP5 shRNA2 and AD - GP5 shRNA3 had the best interference effect , SOD activity and GSH content showed that AD - GP5 shRNA2 group was significantly higher than that of AD - GFP group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S826

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本文編號：1421904