發(fā)布時(shí)間：2018-01-13 03:02

  本文關(guān)鍵詞：基于轉(zhuǎn)錄組和基因組的葡萄無核分子機(jī)制及無核相關(guān)基因功能研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：葡萄(Vitis spp.)是世界第二大水果,無核葡萄更是為現(xiàn)代鮮食消費(fèi)和制干產(chǎn)業(yè)所青睞,無核葡萄因而成為適應(yīng)市場(chǎng)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的育種方向,具有極大的研究?jī)r(jià)值。目前,葡萄無核分子機(jī)制尚未明晰,無核關(guān)鍵基因也有待繼續(xù)挖掘,鑒于此,本研究以有核葡萄‘紅地球’與無核葡萄‘森田尼無核’的雜交分離后代群體為材料,開展了雜交有核、無核葡萄后代胚珠發(fā)育3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析,并采用混樣測(cè)序策略對(duì)葡萄無核親本‘森田尼無核’、有核親本‘紅地球’及其雜交有核、無核后代植株進(jìn)行基因組重測(cè)序,并將轉(zhuǎn)錄組與基因組測(cè)序結(jié)果相結(jié)合對(duì)葡萄無核機(jī)制進(jìn)行探究;同時(shí)系統(tǒng)地從進(jìn)化和表達(dá)模式方面分析葡萄MADS-box基因家族,克隆了2個(gè)無核相關(guān)基因,并進(jìn)行初步功能驗(yàn)證。獲得的主要結(jié)果如下:1、通過對(duì)有核葡萄‘紅地球’與無核葡萄‘森田尼無核’的雜交有核、無核葡萄后代進(jìn)行胚珠發(fā)育的質(zhì)量監(jiān)控,確定胚珠發(fā)育的3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。將所選取時(shí)期的雜交有核、無核葡萄后代各5株進(jìn)行胚珠極端性狀混合池轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得6607個(gè)顯著差異表達(dá)基因,并從差異基因涉及的表達(dá)模式、基因本體注釋、生物學(xué)過程富集、代謝路徑富集、激素響應(yīng)及表觀調(diào)控等方面進(jìn)行多角度的分析。發(fā)現(xiàn)雜交有核、無核葡萄后代胚珠發(fā)育的差異主要集中在種皮發(fā)育、胚乳發(fā)育、激素平衡、表觀遺傳調(diào)控及胚珠身份基因復(fù)合物形成方面。激素水平測(cè)定發(fā)現(xiàn)CTK含量在有核葡萄后代胚珠顯著高于無核后代,GA、IAA和ABA含量則在無核葡萄后代胚珠顯著高于有核后代�；谀Ｊ街参飻M南芥種子發(fā)育的相關(guān)研究,從種皮發(fā)育、胚乳發(fā)育及胚珠發(fā)育基因復(fù)合物形成這3個(gè)主要方面繪制了葡萄胚珠發(fā)育差異基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。2、以有核葡萄‘紅地球’與無核葡萄‘森田尼無核’的雜交有核、無核葡萄后代葉片混合池為材料,通過基因組測(cè)序鑒定到大量的功能性變異位點(diǎn)。通過結(jié)合雜交有核、無核葡萄后代胚珠發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)含有功能性變異位點(diǎn)的差異表達(dá)基因包括抗病蛋白、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞色素P450、纖維素相關(guān)蛋白及鈣調(diào)蛋白等種子發(fā)育相關(guān)因子。主要參與激素平衡調(diào)節(jié)、種皮發(fā)育、胚乳發(fā)育、繁殖器官發(fā)育、氧化還原、衰老死亡等生物學(xué)過程。此外,基于2個(gè)混池基因型頻率,獲得了與無核性狀關(guān)聯(lián)的QTL區(qū)間,通過區(qū)間內(nèi)差異基因的表達(dá)模式篩選到9個(gè)候選基因,并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行不同組織器官和多種有核、無核葡萄胚珠發(fā)育過程的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)其在有核、無核葡萄材料胚珠發(fā)育過程的表達(dá)模式出現(xiàn)差異,結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)和基因功能注釋進(jìn)一步將其認(rèn)定為無核相關(guān)基因。3、在葡萄全基因組共鑒定到54個(gè)葡萄MADS-box基因,并據(jù)其染色體位置進(jìn)行命名。葡萄自身同線性分析表明串聯(lián)重復(fù)和并聯(lián)重復(fù)促進(jìn)了葡萄MADS-box基因家族的擴(kuò)增。擬南芥和葡萄基因組間的同線性分析暗示部分MADS-box基因在這兩個(gè)物種分化前就已經(jīng)存在。進(jìn)化樹分析及內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)分析揭示了葡萄MADS-box基因間的進(jìn)化關(guān)系,并進(jìn)一步將其分成type I和type II兩大類。不同組織器官的表達(dá)分析暗示葡萄MADS-box家族基因既參與繁殖型器官又參與營(yíng)養(yǎng)型器官的發(fā)育。赤霉素處理后葡萄MADS-box家族基因的表達(dá)模式分析揭示其并不顯著響應(yīng)赤霉素,暗示赤霉素處理導(dǎo)致的無核與無核葡萄自然敗育是通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)。通過MADS-box家族基因在6個(gè)葡萄品種胚珠發(fā)育過程的表達(dá)模式分析,暗示葡萄MADS-box基因參與胚珠發(fā)育,且鑒定到5個(gè)在多個(gè)有核、無核品種胚珠差異表達(dá)的基因,初步認(rèn)定其為無核相關(guān)的潛在候選基因。4、基于對(duì)葡萄MADS-box家族基因的進(jìn)化和表達(dá)模式分析,選取2條有核、無核葡萄胚珠發(fā)育差異表達(dá)基因:VvMADS28和VvMADS39基因。其中,VvMADS28基因轉(zhuǎn)錄水平在多個(gè)有核葡萄品種胚珠中明顯高于無核品種;VvMADS39基因轉(zhuǎn)錄水平在多個(gè)有核葡萄品種胚珠中明顯低于無核品種。經(jīng)克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)VvMADS28基因開放閱讀框?yàn)?44bp,編碼247個(gè)氨基酸;VvMADS39基因開放閱讀框?yàn)?41bp,編碼245個(gè)氨基酸。這2個(gè)基因在有核、無核葡萄不同組織器官及花器官的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)其均在花中高表達(dá)。將VvMADS28基因在番茄異源表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)變小,果型下端錐化,種子變小且數(shù)目變多。將VvMADS39基因異源轉(zhuǎn)化番茄后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)明顯變小且種子敗育。且番茄自身與果實(shí)和種子發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)基因番茄植株的花和果實(shí)發(fā)育過程中均較野生型番茄發(fā)生了變化,推測(cè)VvMADS28和VvMADS39基因有可能通過影響這些基因的表達(dá)引發(fā)轉(zhuǎn)基因番茄種子和果實(shí)表型的變化,初步驗(yàn)證了VvMADS28參與種子發(fā)育和VvMADS39與無核相關(guān)的基因功能。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S663.1
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本文編號(hào)：1417143