本文關(guān)鍵詞：E.tenella宿主細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)在線粒體凋亡途徑中的作用與機(jī)理　出處：《山西農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：為了探討E.tenella宿主細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)在線粒體凋亡途徑中的作用與機(jī)理,采用原代雞胚盲腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、分光光度計(jì)技術(shù)、HE染色技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)等,對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM).胞外鈣離子螯合劑(EGTA)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上三磷酸肌醇受體(IP_3R)和蘭諾定受體(RyR)通道阻斷劑(肝素鈉和Ryanodine)、鈣蛋白酶抑制劑(SJA6017)和鈣調(diào)蛋白抑制劑(三氟拉嗪)處理和非處理的E.tenella宿主細(xì)胞凋亡率、蟲體感染率、線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)開放情況、鈣離子濃度、胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C (Cytc)含量、Ca~(2+)-ATP酶活性、細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶含量、細(xì)胞內(nèi)Bax和Bid mRNA及蛋白表達(dá)量、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶含量及細(xì)胞內(nèi)Bad和14-3-3蛋白表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明：(1)接種E.tenella子孢子后4-120h,子孢子接種不加藥組(TO)宿主細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)高于空白對(duì)照組(C),表明E.tenella感染宿主細(xì)胞會(huì)引起宿主細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。(2)接種E.tenella子孢子后,除4h和120h,胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM)組(T3組)的宿主細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)低于TO組；在接種后4h,T3組宿主細(xì)胞凋亡率顯著(P0.05)高于TO組,而在接種后24-120h,T3組宿主細(xì)胞早期凋亡率在48h、96h和120h顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)低于T0組,T3組宿主細(xì)胞晚期凋亡率和壞死率極顯著(P0.01)低于TO組；在接種子孢子后4-120h,T3組宿主細(xì)胞內(nèi)Calcein-AM~+的平均熒光強(qiáng)度都高于TO組,而在96h和120h,T3組細(xì)胞內(nèi)Calcein-AM~+的平均熒光強(qiáng)度顯著(P0.01或P0.05)高于TO組；接種子孢子后4h,T3組細(xì)胞胞漿內(nèi)Cytc的含量顯著高于T0組(P0.05),而接種子孢子后24-120h,T3組細(xì)胞胞漿內(nèi)Cytc的含量低于TO組,其中24h、96h和120h細(xì)胞胞漿內(nèi)Cytc的含量顯著(P0.01或P0.05)低于TO組。由此可得出, E.tenella宿主細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化可以調(diào)節(jié)MPTP開放程度和胞漿內(nèi)Cytc的含量,從而調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡。(3)接種E.tenella子孢子后4-120h,胞外鈣離子螯合劑(EGTA)組(T2組)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP_3R和RyR鈣離子通道阻斷劑(肝素鈉和Ryanodine)子孢子接種組(T1組)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的平均熒光強(qiáng)度都低于TO組,在48h、96h、120h,T2組細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的平均熒光強(qiáng)度極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)低于TO組；在48-96h,T1組細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的平均熒光強(qiáng)度極顯著(P0.01)低于T0組。表明,細(xì)胞外鈣離子濃度的變化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道對(duì)E.tenella宿主細(xì)胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度起著非常重要的調(diào)控作用。(4)接種E.tenella子孢子后4h,T1和T2組宿主細(xì)胞凋亡率、胞漿內(nèi)Cytc都高于TO組,而接種后24-120h,T1和T2組宿主細(xì)胞凋亡率、胞漿內(nèi)Cytc都低于TO組；接種子孢子后4-120h,T1和T2組宿主細(xì)胞內(nèi)Calcein-AM~+的平均熒光強(qiáng)度都高于TO組；在接種子孢子后4h,T1和T2組Ca~(2+)-ATP酶活性低于TO組,而在接種子孢子后24-120h,T2組Ca~(2+)-ATP酶活性高于TO組。表明降低胞外游離鈣離子濃度和阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道可以使E.tenella宿主細(xì)胞降低MPTP開放和Cytc釋放,提高Ca~(2+)-ATP酶活性。(5)接種E.tenella子孢子后4h,子孢子接種不加藥組(TO組)宿主細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶含量極顯著(P0.01)低于C組,而在接種后24-120h,TO組細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶的含量都極顯著(P0.01)高于C組；在接種4h后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM)組(T3組)宿主細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶的含量極顯著高于(P0.01)TO組,在接種后24h、72h、96h和120h T3組宿主細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶的含量極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)低于TO組。表明,E.tenella感染早期會(huì)引起宿主細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶含量降低,而中后期升高,并且降低細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度會(huì)導(dǎo)致鈣蛋白酶的含量減少。(6)接種E.tenella子孢子后4h、48h、96h和120h,鈣蛋白酶抑制劑(SJA6017)組(T4組)宿主細(xì)胞內(nèi)Calcein-AM~+的平均熒光強(qiáng)度顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)高于TO組；在接種后4h,T4組宿主細(xì)胞的早期凋亡率及晚期凋亡率和壞死率都高于TO組,其中晚期凋亡率和壞死率極顯著(P0.01)高于TO組,在接種后24-120h,T4組宿主細(xì)胞的早期凋亡率低于TO組,其中在48h、96h和120h T4組宿主細(xì)胞的早期凋亡率顯著(P0.01或P0.05)低于T0組,在接種后24-120h,T4組宿主細(xì)胞的晚期凋亡率和壞死率極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)低于T0組,表明細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶可以通過調(diào)節(jié)MPTP的通透性調(diào)控E.tenella誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡。(7)接種E.tenella子孢子后4h,TO組宿主細(xì)胞內(nèi)Bax、Bid mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著(P0.01或P0.05)低于C組,T4組Bax、Bid mRNA和蛋白表達(dá)量均高于TO組,其中T4組Bax mRNA表達(dá)量顯著(P0.05)高于T0組；而接種24-120h,TO組宿主細(xì)胞內(nèi)Bax、Bid mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著(P0.05)高于C組,除120h時(shí)外,Bax含量均顯著(P0.01或P0.05)高于C組,T4組Bax、Bid mRNA和蛋白表達(dá)量低于TO組,其中T4組Bax mRNA表達(dá)量在24-72h極顯著(P0.01)低于T0組,Bid mRNA表達(dá)量在24h-120顯著(P0.01或P0.05)低于TO組,Bax蛋白表達(dá)量在48h顯著(P0.05)低于TO組,Bid蛋白含量在48h、72h和120h顯著(P0.01或P0.05)低于TO組。表明感染E.tenella的宿主細(xì)胞Bax、Bid基因表達(dá)上調(diào),鈣蛋白酶可以通過調(diào)節(jié)Bax、Bid的表達(dá)調(diào)控E.tenella誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞線粒體凋亡通路。(8)接種E.tenella子孢子后4h,子孢子接種不加藥組(TO)宿主細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶含量低于C組(P0.05),而在接種后24-120h,除96h外,其余時(shí)間TO組細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的含量都極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)高于C組；在接種后4h,細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM)組(T3組)細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的含量高于TO組(P0.05),而在接種子孢子后24h、48h和120h,T3組細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的含量極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)低于T0組。表明E.tenella感染宿主細(xì)胞早期會(huì)引起宿主細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶含量降低,而中后期升高,并且鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的變化受到細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的調(diào)節(jié)。(9)在接種E.tenella子孢子后4h-120h,鈣調(diào)蛋白抑制劑(三氟拉嗪)組(T5組)細(xì)胞內(nèi)的Calcein-AM~+的平均熒光強(qiáng)度都高于TO組,其中120h T5組細(xì)胞內(nèi)的Calcein-AM~+的平均熒光強(qiáng)度顯著(P0.05)高于T0組；在接種后4h,T5組細(xì)胞的早期凋亡率及晚期凋亡率和壞死率極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)高于TO組,而在接種子孢子后24-120h,T5組細(xì)胞的早期凋亡率均極顯著(P0.01)或顯著(P0.05)低于TO組,T5組宿主細(xì)胞晚期凋亡和壞死率在接種后48h-120h極顯著(P0.01)低于TO組,表明鈣調(diào)蛋白通過調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和MPTP的通透性調(diào)控E.tenella的宿主細(xì)胞凋亡。(10)接種E.tenella子孢子后4h,TO組宿主細(xì)胞內(nèi)Bad、14-3-3蛋白含量顯著(P0.05)低于C組,T5組Bad、14-3-3蛋白含量高于TO組(P0.05)；而接種子孢子后24-120h,TO宿主細(xì)胞內(nèi)組Bad、14-3-3蛋白含量高于C組,其中48-120h,Bad的含量顯著(P0.05)高于C組,在24h、72h、96h和120h,14-3-3蛋白的含量顯著(P0.05)高于C組,T5組宿主細(xì)胞內(nèi)Bad、14-3-3蛋白含量低于TO組,其中在72h,Bad蛋白含量顯著(P0.05)低于TO組。表明E.tenella宿主細(xì)胞Bad、14-3-3蛋白表達(dá)上調(diào),鈣調(diào)蛋白可以通過調(diào)節(jié)Bad、14-3-3的蛋白表達(dá)調(diào)控E.tenella宿主細(xì)胞線粒體凋亡通路。
[Abstract]:The dynamic changes of calcium ion chelating agent ( BAPTA / AM ) , intracellular calcium ion chelating agent ( EGTA ) , calcium ion concentration , intracellular calcium ion chelating agent ( EGTA ) , Ca ~ ( 2 + ) - ATPase activity , intracellular calcium protease content , intracellular Bax and Bid mRNA and protein expression , intracellular calcineurin , intracellular Bad and 14 - 3 - 3 protein expression were measured . The results showed that : ( 1 ) Ca ~ ( 2 + ) - ATPase activity , intracellular calcium protease content , intracellular Bax and Bid mRNA and protein expression were significantly higher than that in the blank control group ( C ) , suggesting that E . tenella infected host cells could cause an increase in calcium ion concentration in host cells . (2)鎺ョE.tenella瀛愬瀛愬悗,闄，

本文編號(hào)：1416942