本文關(guān)鍵詞：雞NOD1基因克隆、功能及信號通路的初步研究　出處：《揚州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：NOD-樣受體(NOD-like receptors, NLR)是胞質(zhì)型模式識別受體(PRR),它同TLR、RLR等一樣,可以通過識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)而迅速啟動先天性免疫反應(yīng),并能通過NF-κB和MAPK等信號傳導(dǎo)途徑啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng),在機體的免疫防御過程中發(fā)揮著重要作用。NOD1是NLR家族中最具代表性的一個成員,在先天性免疫中參與炎癥反應(yīng)和細胞凋亡過程,也與一些炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)。研究報道,NLR家族在人有23個成員,在鼠至少有34個成員,但在禽類的研究報道很少,未見具體有多少成員的明確報道。目前,對于禽類的NOD1的研究尚處于起步階段,而雞是一種重要的模式動物,同時也是重要的經(jīng)濟動物,因此,本研究以雞為研究對象,克隆雞NOD1基因的全長cDNA序列,并進行生物信息學(xué)分析；探查雞NOD1信號通路中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11基因在組織中的表達情況；通過NOD1的特異性配體iE-DAP刺激HD11細胞實驗和RNA干擾實驗,探討雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘柗肿蛹凹毎蜃拥恼{(diào)節(jié)作用；通過體內(nèi)和體外沙門氏菌感染實驗,探討雞NOD1信號通路在抗沙門氏菌感染過程中的作用。1.雞NOD1基因全長cDNA克隆及生物信息學(xué)分析本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR (Reverse transcription PCR)方法,3’和5’末端延伸技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)擴增并獲得雞NOD1基因的全長cDNA序列。該基因全長cDNA為4502bp,包含124bp的5'UTR,2856bp的開放閱讀框(ORF)和1497bp的3'UTR,后接22bp的polyA尾巴。ORF finder分析表明,雞NOD1基因的開放閱讀框位于125-2980區(qū)域,編碼一條含有951個氨基酸的蛋白質(zhì)。采用ProtParam在線軟件進行理化性質(zhì)分析,該蛋白質(zhì)分子量為108676.2Mr,理論等電點(PI)為6.58,總原子數(shù)為15308,分子式為：C4885H7669N1285O1421S48,不穩(wěn)定系數(shù)為36.77,總平均親水性為-0.160。經(jīng)預(yù)測,雞NOD1蛋白無信號肽和跨膜區(qū)。通過NCBI在線BLSTn,將序列直接與雞基因組進行比對,該序列位于雞的2號染色體41824884-41845174位置,基因全長20290bp。預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果表明,雞NOD1蛋白由三個結(jié)構(gòu)域組成,分別為N端的CARD、中間的NACHT以及C端的LRR結(jié)構(gòu)域,經(jīng)比較,與鴨、火雞、人、小鼠、魚的NOD1蛋白結(jié)構(gòu)域一致。利用ClustalW軟件進行多序列比對,并用MEGA軟件基于Poisson Correction模型構(gòu)建了進化樹,表明雞NOD1蛋白與火雞親緣關(guān)系最近,與哺乳類動物的親緣關(guān)系近于與魚類動物的。2. Real-time PCR檢測雞NOD1信號通路相關(guān)分子方法的建立及應(yīng)用根據(jù)GenBank上公布的雞NOD樣受體NOD1、信號傳導(dǎo)分子RIPK2、TRAF6、CARD9、 NF-κB (p65、MAPK11和細胞因子IL-1β、IL-8的mRNA序列,以β-actin為內(nèi)參基因,設(shè)計并合成8個目的基因及1個內(nèi)參基因的PCR擴增引物,建立檢測雞NOD1、RIPK2、 TRAF6、CARD9、NF-κB (p65)、MAPK11和細胞因子IL-1β、IL-8 mRNA表達水平的相對熒光定量PCR方法。試驗結(jié)果顯示,9個基因的熒光定量PCR方法溶解曲線均呈單峰,溶解溫度在81.5℃～89.0℃之間,RT-PCR擴增效率為96.3%～102.3%,相關(guān)系數(shù)為0.966-0.996,斜率為-3.269～-3.413；Ct值的變異系數(shù)在1.85%～3.84%之間。表明,所建立的檢測8個目標基因和1個內(nèi)參基因mRNA表達水平的熒光定量PCR方法特異性強、重復(fù)性高,完全滿足實驗要求,為后續(xù)試驗研究提供技術(shù)支持。3.雞不同組織中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11的表達譜分析NOD1是NLR受體中的一個重要成員,RIPK2是其接頭分子,RIPK2的活化可以引起下游NF-κB和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活,因此,研究雞的不同組織器官中NOD1及其相應(yīng)接頭蛋白RIPK2及信號傳遞分子NF-κB和MAPK11的表達水平,有助于理解和分析機體對病原的先天性免疫應(yīng)答過程。為確定NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11 mRNA在雞體內(nèi)組織中的表達情況,本研究對1日齡雛雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、小腸(十二指腸)、腦、睪丸、卵巢、直腸和血液共13種組織中該四個基因mRNA表達進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11在檢測的13種組織中均有表達,但同一基因在不同組織中的表達量差異較大。其中,NOD1和NF-κB在血液中表達最高,RIPK2、MAPK11在腦組織中表達量最高。說明,NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11在雞體的各組織中廣泛表達。4.雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘柗肿拥恼{(diào)節(jié)作用研究為了探討雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘柾废嚓P(guān)分子的調(diào)節(jié)作用,本研究通過RNAi抑制和外源性iE-DAP誘導(dǎo)NOD1的表達后,檢測了RIPK2、NF-κB、TRAF6、CARD9、MAPK11、 IL-1β和IL-8等基因的表達變化,以探討NOD1在HD11細胞中對這些基因的調(diào)節(jié)作用。本研究構(gòu)建了三個表達質(zhì)粒和一個陰性對照質(zhì)粒,即PLL3.7-NOD1-shRNA1、 PLL3.7-NOD1-shRNA2、PLL3.7-NOD1-shRNA3和PLL3.7-NOD1-control shRNA。三個表達質(zhì)粒在HD11細胞中的抑制效率結(jié)果表明,與PLL3.7-NOD1-control shRNA相比,PLL3.7-NOD1-shRNA1、PLL3.7-NOD1-shRNA2和PLL3.7-NOD1-shRNA3印制效率在48h時分別為34.1%、19.3%和81.4%,在72h時分別為37.9%、58.1%和69.1%。檢測了轉(zhuǎn)染PLL3.7-NOD1-shRNA3表達載體和iE-DAP處理的HD11細胞中的PIPK2、NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11、IL-1β和IL-8的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PLL3.7-NOD1-shRNA3抑制和iE-DAP激活HD11細胞中NOD1的表達水平后,除IL-1p外,信號傳導(dǎo)分子RIPK2、 NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11細胞因子IL-8的表達水平也出現(xiàn)了相應(yīng)的下調(diào)和上調(diào)。這些結(jié)果提示,雞NOD1基因?qū)ζ湫盘柾废掠涡盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)分子RIPK2、 NF-KB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11及細胞因子IL-8的表達具有正向調(diào)節(jié)作用。5.雞NOD1信號通路對沙門氏菌的識別作用已有研究表明沙門氏菌可以激活NOD1信號通路,NOD1蛋白通過與下游的受體作用蛋白-2(RIPK2)分子相互作用,激活NF-κB、MAPK信號通路。然而,在禽類,沙門氏菌感染是否可以激活NOD1信號通路尚不清楚,因此,為了研究雞NOD1信號通路相關(guān)基因在沙門氏菌感染過程中的作用,本研究通過在體實驗,選擇10日齡AA肉雞,經(jīng)皮下每只注射0.2m1濃度為1×108cfu/mL的雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌菌液,同時設(shè)立對照組。檢測沙門氏菌感染后的1d、3d、5d和7d脾臟和血液中NOD1、RIPK2、NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8表達量變化。結(jié)果顯示,雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌感染后,NOD1、RIPK2、 NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8的表達量在感染后的1-7d呈波動變化,表達量高峰是在感染后的3d、5d或7d。在HD11細胞中,用雞白痢沙門氏菌感染細胞,檢測NOD1信號通路相關(guān)基因表達,結(jié)果表明,NOD1基因的表達量在雞白痢沙門氏菌感染的3.5h和6h顯著降低,1h、24h顯著增加；RIPK2在雞白痢沙門氏菌感染后6h,NF-κB在雞白痢沙門氏菌感染后1h表達量顯著下降,3.5h、6h和24h顯著增加；MAPK11的表達量在雞白痢沙門氏菌感染后的1h、6h略有下降但差異不顯著,24h時表達量顯著增加。細胞因子IL-1p和IL-8的表達量在雞白痢沙門氏菌感染后的1h、3.5h、6h和24h的表達量均顯著增加。用iE-DAP處理HD11細胞,再進行雞白痢沙門氏菌感染,檢測雞白痢沙門氏菌對細胞的侵襲率及在細胞內(nèi)的增殖情況。結(jié)果表明,iE-DAP處理組的雞白痢沙門氏菌的侵襲率和未處理組的侵襲率沒有顯著差異,但在4h和6h時,iE-DAP處理組的胞內(nèi)細菌數(shù)量顯著低于未用iE-DAP處理組的細菌數(shù)。結(jié)果提示,雞NOD1信號通路在雞和HD11細胞對沙門氏菌的清除過程中具有重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S831

【參考文獻】

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1 周作勇;雞Toll樣受體對Eimeria tenella的識別及信號通路研究[D];西南大學(xué);2012年

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