本文關(guān)鍵詞：微小隱孢子蟲微線蛋白互作蛋白的篩選與鑒定研究　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)是一種人獸共患的寄生性原蟲,其宿主范圍廣,人畜感染率高,是引起腹瀉的重要病原體之一。對(duì)免疫功能正常的宿主,腹瀉一般為自限性的;對(duì)免疫缺陷的宿主(如AIDS患者),腹瀉多為慢性的持續(xù)水瀉,嚴(yán)重時(shí)可危及生命。迄今對(duì)微小隱孢子蟲致病機(jī)理和入侵機(jī)制的了解較少,對(duì)隱孢子蟲病尚無有效的預(yù)防和治療措施。頂復(fù)門原蟲對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和入侵是其致病的關(guān)鍵,蟲體入侵細(xì)胞時(shí)由頂端細(xì)胞器分泌一系列的蛋白,這些蛋白發(fā)生相互作用導(dǎo)致了蟲體的入侵。微線蛋白是由微線體分泌的一種粘附相關(guān)蛋白,在蟲體入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要作用。Rhomboid蛋白酶是一類膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶,存在于多種頂復(fù)門原蟲體內(nèi),已有研究表明,弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的一個(gè)重要過程是Rhomboid蛋白酶水解其底物微線蛋白。而在C.parvum中,對(duì)微線蛋白起加工作用的Rhomboid蛋白還未見報(bào)道。另外,C.parvum感染宿主時(shí),微線蛋白與宿主蛋白發(fā)生相互作用粘附宿主細(xì)胞是建立感染的重要步驟,因此鑒定與微線蛋白發(fā)生互作的宿主細(xì)胞蛋白對(duì)C.parvum入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制研究有重要意義。目前在微小隱孢子蟲中已報(bào)道的微線蛋白有GP900,TRAP-C1(TRAP)和MIC1,經(jīng)序列分析,GP900和TRAP含有可與Rhomboid蛋白發(fā)生互作的位點(diǎn),故本研究首先對(duì)C.parvum微線蛋白在粘附入侵方面的作用及免疫特性進(jìn)行初步研究,并利用酵母雙雜交、免疫共沉淀技術(shù)以及免疫沉淀-質(zhì)譜法篩選并鑒定與其互作的Rhomboid蛋白和宿主蛋白,為揭示C.parvum入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。微小隱孢子蟲微線蛋白TRAP的粘附侵入功能及免疫特性研究:RT-PCR擴(kuò)增微線蛋白TRAP基因片段后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET28a-TRAP,表達(dá)并純化重組蛋白TRAP,用Western blot方法檢測(cè)r TRAP對(duì)宿主細(xì)胞的粘附作用。用純化的r TRAP免疫小鼠制備抗血清,觀察其體外入侵抑制效果,并對(duì)免疫血清進(jìn)行體液免疫及細(xì)胞免疫水平的檢測(cè)。結(jié)果顯示,重組蛋白TRAP可特異性粘附宿主細(xì)胞,抗r TRAP血清對(duì)子孢子入侵宿主細(xì)胞有明顯的抑制作用。免疫小鼠血清中Ig G抗體水平升高,細(xì)胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ表達(dá)水平明顯升高,說明r TRAP可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。與微小隱孢子蟲微線蛋白相互作用的Rhomboid蛋白的篩選:利用酵母雙雜交系統(tǒng)將C.parvum Rhomboid 1/4,T.gondii Rhomboid 2分別與誘餌載體p GBKT7連接構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒,經(jīng)β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)誘餌蛋白無自激活作用。將C.parvum微線蛋白TRAP和GP900與捕獲載體p GADT7連接構(gòu)建重組捕獲質(zhì)粒,分別與重組誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109,根據(jù)共轉(zhuǎn)化組在選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況和β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)篩選與微線蛋白有相互作用的Rhomboid蛋白。隨后構(gòu)建Rhomboid和微線蛋白的重組真核質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,利用免疫共沉淀方法進(jìn)一步驗(yàn)證兩者間的相互作用。結(jié)果表明C.parvum Rhomboid 1具有體外切割GP900蛋白的活性,T.gondii Rhomboid 2可以體外切割TRAP蛋白。絲氨酸蛋白酶抑制劑DCI對(duì)子孢子入侵宿主細(xì)胞的體外抑制試驗(yàn)顯示,濃度為25μM的DCI可以有效抑制Rhomboid蛋白酶的活性來抑制子孢子對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。與微小隱孢子蟲微線蛋白GP900相互作用的宿主細(xì)胞蛋白的篩選:構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒p GEX-4T-GP900,表達(dá)并純化重組蛋白GP900,與宿主細(xì)胞裂解液孵育結(jié)合,利用免疫沉淀-質(zhì)譜法篩選與GP900互作的宿主蛋白,經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜分析初步篩選出4種宿主細(xì)胞受體蛋白。再利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)GP900與所篩選的宿主蛋白之間的互作進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果鑒定出4種與微線蛋白GP900有相互作用的宿主蛋白,即膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2),β-肌動(dòng)蛋白(ACTB),熱休克蛋白5(HSPA5)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。本試驗(yàn)對(duì)ANXA2進(jìn)行原核表達(dá)并純化,用重組蛋白ANXA2免疫小鼠制備抗血清,進(jìn)行體外抗體阻斷試驗(yàn),結(jié)果表明抗r ANXA2血清對(duì)子孢子入侵宿主細(xì)胞產(chǎn)生一定抑制作用。綜上所述,本試驗(yàn)對(duì)微線蛋白TRAP的粘附功能及免疫特性進(jìn)行了研究,利用酵母雙雜交和免疫共沉淀方法驗(yàn)證得出C.parvum Rhomboid 1具有體外切割微線蛋白GP900的活性。利用免疫沉淀-質(zhì)譜法篩選出4種與微線蛋白GP900互作的宿主蛋白(ANXA2,ACTB,HSPA5,GAPDH),并用酵母雙雜交方法進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究為揭示微小隱孢子蟲入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制提供了理論依據(jù),并為尋找新的防治隱孢子蟲病藥物和候選疫苗靶位奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7

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