本文關(guān)鍵詞：甜味受體T1R3與Gα-味導(dǎo)素在小鼠睪丸類固醇激素合成中的功能及作用機(jī)制研究　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：睪丸是雄性動物最重要的生殖器官,主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生精子與合成雄激素,前者在生精小管完成,后者由睪丸間質(zhì)細(xì)胞完成。間質(zhì)細(xì)胞合成的雄激素(主要是睪酮)對于維持睪丸正常生精功能至關(guān)重要。因此,探討雄性動物睪丸雄激素合成及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。然而,雄激素合成不僅受經(jīng)典的下丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)控,也受間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)許多信號通路局部調(diào)節(jié)。近年來,有研究表明甜味受體T1R3 (Taste receptor family 1 subunit 3, T1R3)及其下游 Gα-味導(dǎo)素(G protein α-gustducin,Gα)蛋白在動物睪丸組織中共表達(dá)。編碼兩蛋白的基因同時敲除后,小鼠表現(xiàn)為雄性不育,并伴隨精液量減少,精子活力低下、形態(tài)異常,生精上皮脫落等表型,提示甜味覺T1R3及Gα是調(diào)控雄性生殖的潛在位點(diǎn),然其具體作用尚未明確。鑒于睪丸甜味覺分子的潛在生物學(xué)功能,甜味劑作為食品與飼料添加劑在日常生活與生產(chǎn)中大量使用,可能與逐年遞增的雄性生殖障礙發(fā)生率存在關(guān)聯(lián),亟待開展對睪丸甜味受體T1R3及其下游信號參與雄性生殖功能的理論研究。基于這一主題,本論文以小鼠為研究對象,探討了出生后不同年齡段睪丸甜味受體T1R3及其下游蛋白Gα的表達(dá)特性;在此基礎(chǔ)上,觀察外源甜味劑對成年小鼠睪丸生物學(xué)功能及其甜味覺T1R3與Gα分子表達(dá)的影響;并解析小鼠睪丸甜味覺T1R3與Gα分子參與睪丸類固醇激素合成的潛在信號機(jī)制;通過哺乳期人工甜味劑處理驗證小鼠初情期睪丸甜味分子參與間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素合成調(diào)控cAMP信號機(jī)制。通過上述研究,初步揭示了甜味覺受體T1R3及其下游蛋白Gα在睪丸中的非味覺功能。其成果,可為雄性不育機(jī)制及甜味劑的合理劑量提供理論儲備和技術(shù)支持。主要結(jié)果如下:1甜味受體T1R3及其下游蛋白Gα在新生仔鼠睪丸組織中的發(fā)育表達(dá)模式Western blot結(jié)果顯示,甜味受體T1R3及其下游蛋白Gα在不同發(fā)育階段(新生7 d、斷奶21 d、初情35 d、成年56 d及老年1.5 yr)的小鼠睪丸中呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢,且初情期和成年期的表達(dá)顯著強(qiáng)于斷奶期與老年期。免疫組化分析揭示了上述表達(dá)變化主要與生精周期中不同階段睪丸延伸精子細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞T1R3與Gα的差異表達(dá)有關(guān)。新生期與斷奶期小鼠睪丸甜味覺T1R3與Gα僅在間質(zhì)細(xì)胞微弱共表達(dá);進(jìn)入初情期后,在整個生精周期的變形精子細(xì)胞(胞質(zhì)與Ⅶ-Ⅷ期變形精子尾部)和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá);成年期后兩蛋白高表達(dá)于整個生精周期延伸精子細(xì)胞(且延伸精子尾部表達(dá)強(qiáng)于胞質(zhì))和間質(zhì)細(xì)胞中;步入老年后,睪丸T1R3與Gα的整體表達(dá)水平顯著下降。此外,本試驗還觀察到小鼠初情后,精子細(xì)胞殘余體和睪丸血管內(nèi)皮細(xì)胞中有T1R3與Gα蛋白表達(dá),而Gα同時在新生7 d小鼠的凋亡精原細(xì)胞中存在�？傊�,出生后小鼠睪丸生精細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞T1R3與Gα的發(fā)育表達(dá)呈階段依賴性,且在生精細(xì)胞周期中呈現(xiàn)細(xì)胞特異性。2甜味劑飲食處理對小鼠睪丸生物學(xué)功能及其甜味覺T1R3與Gα的影響甜味劑(糖精鈉或蔗糖)飲食處理35 d對成年小鼠睪丸生物學(xué)功能的影響呈現(xiàn)出特殊的劑量反應(yīng),其中糖精鈉引起的反應(yīng)與睪丸甜味覺信號分子(甜味受體T1R3與其下游蛋白Gα)有關(guān),與蔗糖不同。具體表現(xiàn)為:中劑量與低劑量糖精鈉處理組小鼠體重與睪丸重顯著增加,血清T略有上升,同時,睪丸甜味覺信號分子T1R3與Gα,以及類固醇激素合成關(guān)鍵因子(中劑量組:StAR、CYP11A1、CYP17A1;·低劑量組:StAR)的表達(dá)增強(qiáng);高劑量組糖精鈉處理的小鼠血清生殖激素(T與E2)水平下降,睪丸受損,精子質(zhì)量差,與其睪丸甜味覺分子T1R3與Gα以及類固醇激素關(guān)鍵因子(StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、17β-HSD)表達(dá)減弱同時發(fā)生,這可能與激活解離caspase-3有關(guān)。此外,高、中劑量蔗糖處理組中小鼠睪丸與精子的異常伴隨著解離caspase-3表達(dá)增強(qiáng),而對T1R3與/或Gα味覺分子表達(dá)無顯著影響。3甜味劑誘導(dǎo)的小鼠睪丸甜味覺T1R3/Gα信號對間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素合成的急性影響睪丸內(nèi)糖精鈉與/或hCG微量注射(0 h, 3 h, 6 h和12 h)試驗表明睪丸甜味覺T1R3與Gα分子參與的間質(zhì)細(xì)胞類固醇合成與胞內(nèi)cAMP有關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示,成年小鼠睪丸甜味覺信號分子T1R3和Gα與其類固醇合成關(guān)鍵因子(StAR、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD)共表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)睪丸內(nèi)注射未對小鼠睪丸指數(shù)及其睪丸組織形態(tài)產(chǎn)生器質(zhì)性影響,各處理組在處理0h,3 h,6 h和12 h后,血糖濃度變化不明顯。放射免疫分析顯示,糖精鈉引起的血清T與E2增加僅在處理后6 h觀察到,且hCG和hCG-糖精鈉引起的血清E2升高也僅發(fā)生在處理后6 h,而血清T在處理3h, 6h和12h均有顯著增加。盡管6h糖精鈉處理小鼠睪丸T分泌低于hCG和hCG-糖精鈉組,但卻顯著高于生理鹽水組與對照組;6 h糖精鈉組血清E2水平則與hCG和hCG-糖精鈉組相當(dāng),且三個處理組均高于生理鹽水組與對照組。此外,Western blot與ELISA試驗結(jié)果表明,6 h糖精鈉注射不僅激活睪丸甜味覺T1R3與Gα蛋白表達(dá),也促進(jìn)了類固醇合成關(guān)鍵因子StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的表達(dá),引起胞內(nèi)cAMP增加。這與預(yù)期結(jié)果相符,睪丸甜味受體T1R3及其下游Gα的激活,促使胞內(nèi)cAMP生成,進(jìn)而誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素合成。與此同時,試驗結(jié)果還表明6 h hCG與糖精鈉聯(lián)合處理減弱了糖精鈉組睪丸甜味覺分子(T1R3與Gα)表達(dá)的同時,不僅降低hCG誘導(dǎo)的胞內(nèi)cAMP生成,還抑制hCG或糖精鈉組類固醇合成酶(CYP17A1、17β-HSD和3β-HSD)的活性,降低hCG組睪酮分泌量。4哺乳期糖精鈉注射的小鼠初情期睪丸甜味覺T1R3與Gα與類固醇激素合成的相關(guān)性研究小鼠哺乳期(1 d-21 d)注射試驗表明哺乳期糖精鈉處理影響小鼠初情期睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素合成與調(diào)控。具體表現(xiàn)為:高、低劑量糖精鈉注射可提高新生小鼠斷奶重與其初情期睪丸指數(shù),其中高劑量糖精鈉引起睪丸指數(shù)上升與升高的血清T、血清E2、睪丸T濃度及降低的睪丸LH濃度有關(guān),而低劑量糖精鈉組的睪丸指數(shù)增加與其血清T、血清E2、睪丸T水平的上調(diào)有關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示甜味覺信號分子(T1R3和 Gα)與類固醇合成關(guān)鍵因子(StAR、CYP11A1、3[3-HSD、CYP17A1 和 17β-HSD)均表達(dá)于初情期小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中。利用Western blot和real time-PCR技術(shù),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)糖精鈉注射可引起小鼠初情期睪丸甜味覺信號分子(T1R3和Gα)與類固醇合成關(guān)鍵因子(StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD)表達(dá)上調(diào),但對睪丸T1R2受體無顯著影響。此外,ELISA檢測結(jié)果顯示,高、低劑量糖精鈉注射組小鼠睪丸cAMP濃度顯著升高,但其CHO與TG變化不明顯。以上結(jié)果提示哺乳期糖精鈉注射引起的小鼠初情期生殖激素變化與甜味覺信號分子(T1R3和Gα)介導(dǎo)的下游cAMP信號有關(guān)。此外,葡萄糖與胰島素耐受研究發(fā)現(xiàn),高、低劑量糖精鈉處理組小鼠空腹血糖濃度高,葡萄糖耐受能力弱,而胰島素敏感性無明顯變化。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S814
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本文編號：1352006