本文關(guān)鍵詞：薄皮甜瓜果實(shí)成熟品質(zhì)形成與蛋白質(zhì)組學(xué)分析　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 薄皮甜瓜 iTRAQ 蛋白質(zhì)組 果實(shí)成熟 品質(zhì) Western-blot

【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var.makuwa Makino)在中國(guó)廣泛栽培,甜脆多汁、香氣濃郁,深受大眾喜愛。在薄皮甜瓜成熟過程中,質(zhì)地、顏色、糖、風(fēng)味和香氣等受到多種因素調(diào)控而發(fā)生變化,涉及大量生理生化變化和基因表達(dá),影響果實(shí)的品質(zhì)。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究果實(shí)成熟過程中的生理生化變化,有利于更好地理解薄皮甜瓜成熟過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)對(duì)品質(zhì)形成的作用。本試驗(yàn)以薄皮甜瓜'玉美人'花后5,15,25和35 d的果實(shí)為試材,通過測(cè)定果實(shí)單果重、硬度、色度、可溶性固形物(SSC)、香氣物質(zhì)、糖含量和內(nèi)源乙烯釋放量等品質(zhì)和生理指標(biāo),研究薄皮甜瓜果實(shí)成熟過程中生理生化特性的變化;利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究薄皮甜瓜成熟過程中4個(gè)不同成熟階段的差異蛋白,獲得與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的重要蛋白;分別從基因表達(dá)、酶活性和Western-blot蛋白半定量三個(gè)方面驗(yàn)證α-亞麻酸代謝、淀粉及蔗糖代謝和糖酵解途徑中關(guān)鍵差異蛋白脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX),醇脫氫酶(Alcohol dehydeogenase,ADH),醇�；D(zhuǎn)移酶(Alchol acyl transferase,AAT),蔗糖合成酶(Sucrose synthetase,SS)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthetase,SPS)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的表達(dá)規(guī)律。主要研究結(jié)果如下:1.以花后4個(gè)不同時(shí)期薄皮甜瓜的果實(shí)為試材,對(duì)果實(shí)成熟過程中的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在果實(shí)成熟過程中,果實(shí)硬度先升高后下降,在花后25 d達(dá)到最大值,果皮褪綠變黃,果實(shí)單果重和可溶性固形物含量顯著升高,均在花后35 d達(dá)到最大值,乙烯釋放量顯著升高,表明花后35 d為薄皮甜瓜'玉美人'的生理成熟期。2.通過利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜技術(shù)測(cè)定不同成熟階段薄皮甜瓜果實(shí)的香氣物質(zhì)和糖含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在果實(shí)成熟過程中共鑒定出39種香氣物質(zhì),包括17種酯類,12種醇類,4種醛類和4種酸類物質(zhì)。在果實(shí)成熟過程中,醛類物質(zhì)含量無明顯變化,酸類物質(zhì)含量顯著下降,醇類和酯類物質(zhì)含量顯著升高,其中酯類物質(zhì)的種類和含量在花后35 d迅速升高達(dá)到峰值,鑒定出的主要酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯和乙酸己酯等。主成分分析結(jié)果表明,酸類物質(zhì)和酯類物質(zhì)變化呈負(fù)相關(guān),花后5d與15d的果實(shí)香氣物質(zhì)相似,主要為酸類、醇類和醛類物質(zhì),花后25 d和35 d的果實(shí)主要香氣物質(zhì)分別為醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)。在甜瓜果實(shí)成熟過程中,果糖和葡萄糖積累緩慢且同步,在花后35 d,蔗糖迅速積累達(dá)到最大值。3.利用iTRAQ技術(shù)對(duì)花后4個(gè)時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究,共鑒定出5835個(gè)蛋白,1694個(gè)差異蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度,將差異蛋白聚為4類,分別為花后35,25,15和5 d達(dá)到峰值的蛋白。對(duì)4類蛋白進(jìn)行GO功能富集分析,其中第1類蛋白(在35 d達(dá)到峰值)主要參與響應(yīng)逆境脅迫,果實(shí)成熟,脂肪酸代謝等過程;第2類蛋白(在25 d達(dá)到峰值)參與的生物學(xué)過程主要包括響應(yīng)氧化脅迫,細(xì)菌防御,滲透脅迫,甘油醚代謝過程;第3類蛋白(在15d達(dá)到峰值)主要參與激素調(diào)節(jié),根系發(fā)育;第4類蛋白(在5d達(dá)到峰值)主要參與DNA復(fù)制,rRNA處理,mRNA結(jié)合等。4.利用KEGG數(shù)據(jù)庫信息分析差異蛋白質(zhì)所在的生物學(xué)通路及相互關(guān)系,篩選出αα-亞麻酸代謝,淀粉及蔗糖代謝,糖酵解三個(gè)代謝途徑中差異蛋白LOX、ADH、AAT、SS和SPS。在果實(shí)成熟過程中,兩類LOX蛋白表達(dá)變化規(guī)律不同,13-LOX蛋白先上調(diào),在25d達(dá)到峰值后略下調(diào),9-LOX蛋白顯著上調(diào),ADH、AAT、SS和SPS蛋白均顯著上調(diào)。5.為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組的結(jié)果,利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)差異蛋白LOX、ADH、AATT、SS和SPS在基因水平進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CmLOXs18個(gè)基因家族成員在果實(shí)成熟過程中表達(dá)趨勢(shì)不同,CmLOX06,CmLOX10-15和CnLOX18與13-LOX蛋白表達(dá)模式相同,CmLOX07-09,CmLOX16和CmLOX17與9-LOX蛋白表達(dá)模式相同;除了 CmAAT3外,CmAAT1,CmAAT和 與 AAT4 蛋白表達(dá)趨勢(shì)相同;CmSS1和CmSPS1在果實(shí)成熟過程中表達(dá)量顯著升高,與其蛋白表達(dá)趨勢(shì)相同。6.通過測(cè)定酶活性,制備CmLOX09、CmLOX18 CmADH2、CmAAT1、CmSS1和CmSPS1的多克隆抗體,對(duì)差異蛋白進(jìn)行酶活性和Western-blot蛋白半定量驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LOX、ADH、AAT、SS和SPS酶活性均與其對(duì)應(yīng)差異蛋白在4個(gè)時(shí)期的變化規(guī)律相一致;CmLOX09蛋白表達(dá)量在不同成熟時(shí)期變化不明顯,在花后35 d表達(dá)量略高于其他時(shí)期;CmLOX18在花后25 d蛋白表達(dá)量急劇增加后,此后在花后35 d逐漸下降;CmADH2蛋白表達(dá)豐度不高,在花后25-35 d,表達(dá)量有升高的趨勢(shì)但變化不明顯;CmAAT1蛋白僅在花后35 d大量表達(dá);CmSS1和CmSPS1蛋白均在花后35 d維持較高的水平。這6個(gè)差異蛋白的Western-blot結(jié)果均與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果相一致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S652

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