本文關鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在布魯氏菌體外感染山羊子宮內(nèi)膜與滋養(yǎng)層細胞中的作用　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 布魯氏菌 子宮內(nèi)膜上皮細胞 山羊滋養(yǎng)層細胞 凋亡

【摘要】：懷孕母畜流產(chǎn)是布魯氏菌侵染宿主后所引發(fā)的最主要的并發(fā)癥。滋養(yǎng)層細胞是除單核-巨噬細胞外布魯氏菌侵染的主要靶細胞,子宮內(nèi)膜上皮細胞是與滋養(yǎng)層細胞在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關的細胞。研究證實布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)的侵染、增殖與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)密切相關,布魯氏菌能夠利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為其在細胞內(nèi)的增殖部位,從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也是細胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)合成、運輸、分泌的主要場所,對于維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。當細胞的穩(wěn)態(tài)因為病原菌的感染而被打破,就會引發(fā)宿主細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)來恢復細胞的正常功能。布魯氏菌進入宿主細胞后ERA-BCV(Endoplasmic reticulum associated-Brucella containing vacuoles)的形成和宿主細胞凋亡的抑制是其逃避殺傷、進而生存和增殖的關鍵。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡缺失引起的ER stress是誘發(fā)細胞凋亡的重要途徑之一。然而,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在布魯氏菌侵染懷孕母畜子宮并引起懷孕母畜流產(chǎn)的機制至今尚不清楚。本研究利用豬布魯氏菌S2株(Brucella suis strain 2,B.suis S2)體外感染山羊滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜上皮細胞,利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路相關的各種抑制劑、激活劑和免疫熒光,基因的過表達和沉默,熒光定量RT-PCR,流式細胞術(shù),Western Blot等相關的實驗技術(shù)來探索(1)布魯氏菌S2株對山羊滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜上皮細胞的侵染能力;(2)布魯氏菌S2株增殖對山羊滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜上皮細胞凋亡的影響;(3)布魯氏菌S2株增殖對山羊滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜上皮細胞ER stress的激活;(4)操控滋養(yǎng)層細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)對布魯氏菌S2株增殖的影響;(5)布魯氏菌S2株增殖對山羊滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜上皮細胞生物活性的影響。1.通過激光共聚焦顯微鏡及菌落計數(shù)的方法,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株無論是對親嗜性的滋養(yǎng)層細胞還是非親嗜性的子宮內(nèi)膜上皮細胞都表現(xiàn)出一定的感染性,且在這兩種細胞內(nèi)隨著感染時間增加具有明顯的增殖現(xiàn)象。2.通過流式細胞術(shù)、免疫熒光、Western Blot和熒光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株感染不同的細胞對其損害程度不同,對于其靶細胞滋養(yǎng)層的侵染能夠引起宿主細胞的凋亡并且伴發(fā)相應的細胞凋亡信號分子的表達。而對于其非靶細胞山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞的侵染,并沒有引起山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞的凋亡和相應的凋亡信號分子的顯著改變。因此,布魯氏菌侵染對滋養(yǎng)層細胞的損害可能是引發(fā)流產(chǎn)的主要原因。3.通過免疫熒光、Western Blot和熒光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株無論是在親嗜性的滋養(yǎng)層細胞還是在非親嗜性的子宮內(nèi)膜上皮細胞內(nèi)增殖過程中,都激發(fā)了宿主細胞相應的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。然而,激活的UPR通路不同,最主要的原因是不同宿主細胞對布魯氏菌侵染所表現(xiàn)出的抵抗力不同。4.通過免疫熒光、Western Blot和熒光定量PCR的方法,利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激活劑(Tm)、抑制劑(4-PBA),IRE1抑制劑(Irestatin 9389),自噬抑制劑(氯喹)和GRP78基因過表達和沉默等操控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘發(fā)的宿主細胞凋亡反應和自噬反應影響到了布魯氏菌S2株在滋養(yǎng)層細胞內(nèi)的增殖,然而僅僅影響滋養(yǎng)層細胞內(nèi)IRE1α蛋白表達對布魯氏菌S2株的在滋養(yǎng)層細胞內(nèi)增殖沒有顯著地影響。5.利用山羊胎盤滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜上皮細胞共培養(yǎng)及孕激素的聯(lián)合使用,體外構(gòu)建了山羊妊娠子宮模型,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株對妊娠子宮體外模型侵染的過程中,主要通過打破滋養(yǎng)層細胞的內(nèi)分泌平衡和子宮內(nèi)膜上皮細胞的容受性而不是損害滋養(yǎng)層細胞的遷移和侵襲能力來引起妊娠母畜的流產(chǎn)和早產(chǎn),這一過程同樣伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生。以上結(jié)果表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在布魯氏菌S2株體外感染山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞和滋養(yǎng)層細胞過程中起著重要的作用,布魯氏菌S2株在山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞和滋養(yǎng)層細胞內(nèi)的增殖激活了不同的ER stress-UPR通路。宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的細胞凋亡和自噬反應影響了布魯氏菌S2株在滋養(yǎng)層細胞內(nèi)的增殖。此外,布魯氏菌S2株在侵染并激活山羊子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的同時,損害了滋養(yǎng)層細胞的內(nèi)分泌平衡和子宮內(nèi)膜上皮細胞的容受性。本研究從病原入侵,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和生殖內(nèi)分泌角度探索了布魯氏菌侵染導致流產(chǎn)的部分機制。我們的研究結(jié)果將為完善布魯氏菌感染的調(diào)控機理提供新的理論依據(jù)。同時為全面認識布魯氏菌導致不育、流產(chǎn)的機制提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S857.21
，

本文編號：1351343