發(fā)布時間：2017-12-29 16:16

  本文關鍵詞：樟芝無性孢子介導的高效循環(huán)發(fā)酵策略及其產(chǎn)孢分子機制解析　出處：《江南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：樟芝(Antrodia camphorata, Antrodia cinnamomea),又名牛樟芝、牛樟菇、樟內(nèi)菇等,是我國臺灣地區(qū)特有的一種珍稀藥食用真菌,具有抗癌、保肝、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等多種生物活性。但野生樟芝子實體寄主專一,生長緩慢,較為稀缺,難以滿足市場需求。深層發(fā)酵工藝由于生產(chǎn)周期短、批次穩(wěn)定性好,是規(guī)�；a(chǎn)樟芝及其活性成分的主要方式。然而,目前樟芝深層發(fā)酵工藝在大規(guī)模生產(chǎn)過程中仍然存在一些問題,如種子制備過程繁瑣而耗時、生產(chǎn)周期能否進一步縮短、生產(chǎn)成本能否進一步降低、生產(chǎn)效率能否進一步提高等。本課題組首次報道了樟芝深層發(fā)酵后期在合適的環(huán)境和營養(yǎng)條件下能夠大量產(chǎn)生無性孢子的現(xiàn)象,并發(fā)現(xiàn)將樟芝節(jié)孢子接入新鮮培養(yǎng)基中能夠快速萌發(fā)并啟動新一輪發(fā)酵。本文充分利用了樟芝在深層發(fā)酵后期會大量產(chǎn)生無性孢子以及形成的菌絲球與孢子容易分離的特性,建立了樟芝無性孢子介導的高效循環(huán)發(fā)酵工藝,縮短了生產(chǎn)周期、節(jié)約了生產(chǎn)成本、提高了生產(chǎn)效率。然而,在深層發(fā)酵后期及時產(chǎn)生大量的無性孢子是樟芝循環(huán)發(fā)酵工藝進行多批次穩(wěn)定發(fā)酵生產(chǎn)應用的必要條件。因此,為了保障樟芝高效循環(huán)發(fā)酵工藝的持續(xù)性及批次穩(wěn)定性,本文采用2DE、RNA-seq、RT-qPCR等技術手段,對不同發(fā)酵時期的樟芝菌絲體進行蛋白質組學及轉錄組學等相關分析,預測了樟芝深層發(fā)酵無性產(chǎn)孢過程的分子調(diào)控機制,并通過營養(yǎng)限制、Ca2+誘導等方式對該調(diào)控機制進行驗證,為實現(xiàn)樟芝深層發(fā)酵無性產(chǎn)孢過程的穩(wěn)定可控奠定了理論基礎。本文主要結論如下:(1)建立了無性孢子介導的樟芝高效循環(huán)發(fā)酵工藝,縮短了生產(chǎn)周期,節(jié)約了生產(chǎn)成本,提高了生產(chǎn)效率。樟芝循環(huán)發(fā)酵工藝可穩(wěn)定生產(chǎn)8個批次,持續(xù)高效生產(chǎn)2個月。與傳統(tǒng)批次發(fā)酵相比,將8個批次的總生產(chǎn)時間由80 d縮短到58 d,將平均生產(chǎn)周期由10 d縮短到7 d。同時,胞內(nèi)多糖批次生產(chǎn)力提高了 40.3%,總三萜批次生產(chǎn)力提高了 43.2%, AtrodinA批次生產(chǎn)力提高了 42.5%, AtrodinB批次生產(chǎn)力提高了 58.6%。(2)預測了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導的無性產(chǎn)孢信號通路,為實現(xiàn)樟芝深層發(fā)酵無性產(chǎn)孢過程的穩(wěn)定可控及保障樟芝高效循環(huán)發(fā)酵工藝的持續(xù)性和批次穩(wěn)定性奠定了理論基礎。采用2DE、RNA-seq、RT-qPCR等技術手段,對樟芝無性孢子及不同發(fā)酵時間的菌絲體進行了蛋白質組學和轉錄組學等相關分析,并結合相關文獻信息預測了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導的無性產(chǎn)孢信號通路。即,在無性產(chǎn)孢之前,SfgA蛋白通過結合在flbA、flbB、flbC等基因的啟動子上,阻遏flbA、flbB、flbC等基因的表達;同時,FluG蛋白逐漸積累并參與合成胞外產(chǎn)孢誘導因子(Extracellular sporulation inducing factor,ESIF),當FluG蛋白積累到一定濃度或受產(chǎn)孢信號誘導時,便通過ESIF移除SfgA蛋白來激活flbA、flbB、flbC等基因;隨后,FlbA通過抑制G蛋白介導的信號通路來促進產(chǎn)孢,而G蛋白介導的信號通路抑制產(chǎn)孢、促進生長;FlbB激活flbD基因后,與FlbD形成FlbB-FlbD異質二聚體,并與FlbC共同作用移除結合在brlA基因啟動子上的阻遏蛋白NsdD而激活brlA基因;BrlA激活abaA基因,AbaA進一步激活wetA基因,而wetA基因直接導致無性產(chǎn)孢及促進孢子成熟;此外,AbaA可促進vosA和velB基因的表達,而VosA和VelB形成的VosA-VelB異質二聚體可促進孢子成熟并抑制brlA基因表達;同時,VeA抑制brlA基因表達,而StuA促進brlA基因表達。(3)分析了樟芝無性產(chǎn)孢過程對營養(yǎng)限制誘導的響應機制,驗證了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導的無性產(chǎn)孢信號通路。采用RNA-seq及RT-qPCR等技術手段,對不同營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的樟芝菌絲體進行了轉錄組學等相關分析,并結合相關文獻信息預測了營養(yǎng)限制誘導樟芝無性產(chǎn)孢的分子調(diào)控機制。即,當?shù)囸I時,細胞中相應的傳感器將信號傳遞給areA和tmpA等基因并促進其表達。其中,AreA直接或間接作用于flbD并促進其表達,進而促進brlA表達,而TmpA直接或間接作用于brlA并促進其表達;當碳饑餓時,轉運蛋白Rco-3作為葡萄糖傳感器將信號直接或間接傳遞給brlA并促進其表達;BrlA促進abaA基因的表達,AbaA進一步促進wetA基因的表達,而wetA基因直接導致無性產(chǎn)孢及促進孢子成熟;此外,當營養(yǎng)(碳或氮)饑餓時,相應的傳感器將信號直接或間接傳遞給gulC和chsD等基因并促進其表達,協(xié)助孢子細胞壁組分的合成,促進孢子成熟。同時,gulC還能促進細胞自溶,為產(chǎn)孢過程提供能量及合成原料。(4)分析了樟芝無性產(chǎn)孢過程對Ca2+誘導的響應機制,進一步驗證了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導的無性產(chǎn)孢信號通路。采用2DE及RT-qPCR等技術手段,分析了添加不同濃度Ca2+培養(yǎng)的樟芝菌絲體的差異表達蛋白,預測了 Ca2+/鈣調(diào)素和FluG介導的樟芝無性產(chǎn)孢信號通路。即,環(huán)境中的Ca2+通過鈣通道蛋白(Cch1和Mid1)進入細胞質與鈣調(diào)蛋白(CaM)結合形成Ca2+-CaM復合體并激活鈣調(diào)磷酸酶,同時熱休克蛋白大量合成。crz1基因被鈣調(diào)磷酸酶激活后,其編碼的轉錄因子Crz1直接作用于abaA基因并促進其表達;鈣調(diào)磷酸酶或HSP90直接或間接地促進產(chǎn)孢上游調(diào)控途徑中的flbA、flbB和flbC基因表達,進而促進brlA基因表達或抑制G蛋白介導的信號通路,最終達到促進產(chǎn)孢的效果;HSP90和WetA參與細胞壁組分的合成,都能促進孢子成熟。
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【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S567.3;TQ920.6

【參考文獻】

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1 賴敏男;;臺灣牛樟芝發(fā)展史及人工栽培現(xiàn)況[J];食藥用菌;2017年02期

2 王麗平;陸小路;趙宗杰;;中藥牛樟芝研究進展[J];今日藥學;2017年02期

3 李晶;林雄杰;林冬梅;魯國東;林占q，

本文編號：1350920