本文關(guān)鍵詞：樟芝無性孢子介導(dǎo)的高效循環(huán)發(fā)酵策略及其產(chǎn)孢分子機(jī)制解析　出處：《江南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：樟芝(Antrodia camphorata, Antrodia cinnamomea),又名牛樟芝、牛樟菇、樟內(nèi)菇等,是我國臺灣地區(qū)特有的一種珍稀藥食用真菌,具有抗癌、保肝、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等多種生物活性。但野生樟芝子實體寄主專一,生長緩慢,較為稀缺,難以滿足市場需求。深層發(fā)酵工藝由于生產(chǎn)周期短、批次穩(wěn)定性好,是規(guī)�；a(chǎn)樟芝及其活性成分的主要方式。然而,目前樟芝深層發(fā)酵工藝在大規(guī)模生產(chǎn)過程中仍然存在一些問題,如種子制備過程繁瑣而耗時、生產(chǎn)周期能否進(jìn)一步縮短、生產(chǎn)成本能否進(jìn)一步降低、生產(chǎn)效率能否進(jìn)一步提高等。本課題組首次報道了樟芝深層發(fā)酵后期在合適的環(huán)境和營養(yǎng)條件下能夠大量產(chǎn)生無性孢子的現(xiàn)象,并發(fā)現(xiàn)將樟芝節(jié)孢子接入新鮮培養(yǎng)基中能夠快速萌發(fā)并啟動新一輪發(fā)酵。本文充分利用了樟芝在深層發(fā)酵后期會大量產(chǎn)生無性孢子以及形成的菌絲球與孢子容易分離的特性,建立了樟芝無性孢子介導(dǎo)的高效循環(huán)發(fā)酵工藝,縮短了生產(chǎn)周期、節(jié)約了生產(chǎn)成本、提高了生產(chǎn)效率。然而,在深層發(fā)酵后期及時產(chǎn)生大量的無性孢子是樟芝循環(huán)發(fā)酵工藝進(jìn)行多批次穩(wěn)定發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用的必要條件。因此,為了保障樟芝高效循環(huán)發(fā)酵工藝的持續(xù)性及批次穩(wěn)定性,本文采用2DE、RNA-seq、RT-qPCR等技術(shù)手段,對不同發(fā)酵時期的樟芝菌絲體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等相關(guān)分析,預(yù)測了樟芝深層發(fā)酵無性產(chǎn)孢過程的分子調(diào)控機(jī)制,并通過營養(yǎng)限制、Ca2+誘導(dǎo)等方式對該調(diào)控機(jī)制進(jìn)行驗證,為實現(xiàn)樟芝深層發(fā)酵無性產(chǎn)孢過程的穩(wěn)定可控奠定了理論基礎(chǔ)。本文主要結(jié)論如下:(1)建立了無性孢子介導(dǎo)的樟芝高效循環(huán)發(fā)酵工藝,縮短了生產(chǎn)周期,節(jié)約了生產(chǎn)成本,提高了生產(chǎn)效率。樟芝循環(huán)發(fā)酵工藝可穩(wěn)定生產(chǎn)8個批次,持續(xù)高效生產(chǎn)2個月。與傳統(tǒng)批次發(fā)酵相比,將8個批次的總生產(chǎn)時間由80 d縮短到58 d,將平均生產(chǎn)周期由10 d縮短到7 d。同時,胞內(nèi)多糖批次生產(chǎn)力提高了 40.3%,總?cè)婆紊a(chǎn)力提高了 43.2%, AtrodinA批次生產(chǎn)力提高了 42.5%, AtrodinB批次生產(chǎn)力提高了 58.6%。(2)預(yù)測了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導(dǎo)的無性產(chǎn)孢信號通路,為實現(xiàn)樟芝深層發(fā)酵無性產(chǎn)孢過程的穩(wěn)定可控及保障樟芝高效循環(huán)發(fā)酵工藝的持續(xù)性和批次穩(wěn)定性奠定了理論基礎(chǔ)。采用2DE、RNA-seq、RT-qPCR等技術(shù)手段,對樟芝無性孢子及不同發(fā)酵時間的菌絲體進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等相關(guān)分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)信息預(yù)測了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導(dǎo)的無性產(chǎn)孢信號通路。即,在無性產(chǎn)孢之前,SfgA蛋白通過結(jié)合在flbA、flbB、flbC等基因的啟動子上,阻遏flbA、flbB、flbC等基因的表達(dá);同時,FluG蛋白逐漸積累并參與合成胞外產(chǎn)孢誘導(dǎo)因子(Extracellular sporulation inducing factor,ESIF),當(dāng)FluG蛋白積累到一定濃度或受產(chǎn)孢信號誘導(dǎo)時,便通過ESIF移除SfgA蛋白來激活flbA、flbB、flbC等基因;隨后,FlbA通過抑制G蛋白介導(dǎo)的信號通路來促進(jìn)產(chǎn)孢,而G蛋白介導(dǎo)的信號通路抑制產(chǎn)孢、促進(jìn)生長;FlbB激活flbD基因后,與FlbD形成FlbB-FlbD異質(zhì)二聚體,并與FlbC共同作用移除結(jié)合在brlA基因啟動子上的阻遏蛋白NsdD而激活brlA基因;BrlA激活abaA基因,AbaA進(jìn)一步激活wetA基因,而wetA基因直接導(dǎo)致無性產(chǎn)孢及促進(jìn)孢子成熟;此外,AbaA可促進(jìn)vosA和velB基因的表達(dá),而VosA和VelB形成的VosA-VelB異質(zhì)二聚體可促進(jìn)孢子成熟并抑制brlA基因表達(dá);同時,VeA抑制brlA基因表達(dá),而StuA促進(jìn)brlA基因表達(dá)。(3)分析了樟芝無性產(chǎn)孢過程對營養(yǎng)限制誘導(dǎo)的響應(yīng)機(jī)制,驗證了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導(dǎo)的無性產(chǎn)孢信號通路。采用RNA-seq及RT-qPCR等技術(shù)手段,對不同營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的樟芝菌絲體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)等相關(guān)分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)信息預(yù)測了營養(yǎng)限制誘導(dǎo)樟芝無性產(chǎn)孢的分子調(diào)控機(jī)制。即,當(dāng)?shù)囸I時,細(xì)胞中相應(yīng)的傳感器將信號傳遞給areA和tmpA等基因并促進(jìn)其表達(dá)。其中,AreA直接或間接作用于flbD并促進(jìn)其表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)brlA表達(dá),而TmpA直接或間接作用于brlA并促進(jìn)其表達(dá);當(dāng)碳饑餓時,轉(zhuǎn)運蛋白Rco-3作為葡萄糖傳感器將信號直接或間接傳遞給brlA并促進(jìn)其表達(dá);BrlA促進(jìn)abaA基因的表達(dá),AbaA進(jìn)一步促進(jìn)wetA基因的表達(dá),而wetA基因直接導(dǎo)致無性產(chǎn)孢及促進(jìn)孢子成熟;此外,當(dāng)營養(yǎng)(碳或氮)饑餓時,相應(yīng)的傳感器將信號直接或間接傳遞給gulC和chsD等基因并促進(jìn)其表達(dá),協(xié)助孢子細(xì)胞壁組分的合成,促進(jìn)孢子成熟。同時,gulC還能促進(jìn)細(xì)胞自溶,為產(chǎn)孢過程提供能量及合成原料。(4)分析了樟芝無性產(chǎn)孢過程對Ca2+誘導(dǎo)的響應(yīng)機(jī)制,進(jìn)一步驗證了樟芝深層發(fā)酵過程中FluG介導(dǎo)的無性產(chǎn)孢信號通路。采用2DE及RT-qPCR等技術(shù)手段,分析了添加不同濃度Ca2+培養(yǎng)的樟芝菌絲體的差異表達(dá)蛋白,預(yù)測了 Ca2+/鈣調(diào)素和FluG介導(dǎo)的樟芝無性產(chǎn)孢信號通路。即,環(huán)境中的Ca2+通過鈣通道蛋白(Cch1和Mid1)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合體并激活鈣調(diào)磷酸酶,同時熱休克蛋白大量合成。crz1基因被鈣調(diào)磷酸酶激活后,其編碼的轉(zhuǎn)錄因子Crz1直接作用于abaA基因并促進(jìn)其表達(dá);鈣調(diào)磷酸酶或HSP90直接或間接地促進(jìn)產(chǎn)孢上游調(diào)控途徑中的flbA、flbB和flbC基因表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)brlA基因表達(dá)或抑制G蛋白介導(dǎo)的信號通路,最終達(dá)到促進(jìn)產(chǎn)孢的效果;HSP90和WetA參與細(xì)胞壁組分的合成,都能促進(jìn)孢子成熟。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S567.3;TQ920.6

【參考文獻(xiàn)】

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1 賴敏男;;臺灣牛樟芝發(fā)展史及人工栽培現(xiàn)況[J];食藥用菌;2017年02期

2 王麗平;陸小路;趙宗杰;;中藥牛樟芝研究進(jìn)展[J];今日藥學(xué);2017年02期

3 李晶;林雄杰;林冬梅;魯國東;林占q，

本文編號：1350920